第二十一章DNA重组及重组DNA技术.pptx

生物化学与分子生物学; DNA重组和重组DNA技术 DNA Recombination and Recombinant DNA technology;DNA重组（DNA recombination）是指不同DNA分子断裂和连接而产生DNA片段的交换并重新组合形成新DNA分子的过程。 重组DNA技术（recombinant DNA technology）是指在体外将两个或两个以上DNA分子重新组合并在适当细胞中增殖形成新DNA分子的过程。 ;第一节自然界DNA重组和基因转移DNA Recombination and Gene Transfer in Nature;DNA重组;发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologous recombination)，又称基本重组（general recombination）。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。 以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机制的Holliday模型;Holliday模型的4个关键步骤： ;片段重组体 切开的链与原来断裂的是同一条链，重组 体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。;参与细菌DNA同源重组的酶有数十种，其中最关键的是RecA蛋白、RecBCD复合物和RuvC蛋白。 RecBCD复合物具有三种酶活性，即依赖于ATP的核酸外切酶活性、可被ATP增强的核酸内切酶活性以及需要ATP的解螺旋酶活性。 RecA蛋白可结合单链DNA（ssDNA），形成RecA-ssDNA复合物。 RuvC有内切酶活性，能专一性识别Holliday连接点，并有选择地切开同源重组体的中间体。 ; 内切酶 (recBCD);Holliday中间体;;λ噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体的特异靶位点发生选择性整合；反转录病毒整合酶可特异地识别、整合反转录病毒cDNA的长末端重复序列(long terminal repeat, LTR)。 ;（二）细菌的特异位点重组;hix为反向重复序列，它们之间的H片段可在Hin控制下进行特异位点重组(倒位)。H片段上有两个启动子P，其一驱动hin基因表达，另一正向时驱动H2和rH1基因表达，反向(倒位)时H2和rH1不表达。rH1为H1的阻遏蛋白基因。; H2鞭毛素;（三）免疫球蛋白基因的重排;重链(IgH)基因的V-D-J重排和轻链(IgL)基因的V-J重排均发生在特异位点上。在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的两侧均存在保守的重组信号序列(recombination signal sequence, RSS)。此重排的重组酶基因rag (recombination activating gene)共有两个，分别产生蛋白质RAG1和RAG2。 ;免疫球蛋白基因重排过程;三、转座重组可使基因移位; 插入序列(insertion sequences, IS)组成：;插入序列发生转座的形式：;插入序列的复制性转座;转座子(transposons) ——可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。; 细菌的可流动性元件 A插入序列：转座酶编码基因两侧连接反向末端重复序列(箭头所示) B转座子Tn3：含有转座酶、β-内酰胺酶及阻遏蛋白编码基因 C转座子Tn10：含四环素抗性基因及两个相同的插入序列IS10L;由转座子介导的转座;四、原核细胞可通过接合、转化和转导进行基因转移或重组;可接合质粒如 F 因子(F factor) ;（二）转化作用;例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。;（三）转导作用;λ噬菌体的生活史;第二节 重组DNA技术;重组DNA技术的发展史;重组DNA技术相关概念;技术水平：分子克隆(molecular clone) （即DNA 克隆） 细胞克隆 个体克隆（动物或植物）　;其主要过程包括：在体外将目的DNA片段与能自主复制的遗传元件（又叫载体）连接，形成重组DNA分子，进而在受体细胞中复制、扩增，从而获得单一DNA分子的大量拷贝。; 目的： ① 分离获得某一感兴趣的基因或DNA ② 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）;一、重组DNA技术中常用的工具酶;重组DNA技术中常用的工具酶;限制性核酸内切酶(restriction endonuclease) ;与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。;第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。;Ⅱ类酶识别序列