毕赤酵母表达系统资料整理.pdf

Mut+和 Muts 毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶 ——AOX1及 AOX2，细胞中大多数的 醇氧化酶是 AOX1基因产物，甲醇可紧密调节、诱导 AOX1基因的高水平表达， 较典型的是占可溶性蛋白的 30%以上。AOX1基因调控分两步： 抑制 / 去抑制机制加诱导机制。简单来说，在含葡萄糖的培养基中，即使加 入诱导物甲醇转录仍受抑制。为此，用甲醇进行优化诱导时，推荐在甘油培养 基中培养。注意即使在甘油中生长 (去抑制 )时，仍不足以使 AOX1基因达到最低 水平的表达，诱导物甲醇是 AOX1基因可辨表达水平所必需的。 AOX1基因已被 分离，含 AOX1 启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。 AOX2基因与 AOX1基因有 97%的同源性，但在甲醇中带 AOX2基因的菌株比带 AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离 Muts 菌株。在 YPD(酵母膏、蛋白胨、葡萄糖 )培养基中，不论是 Mut+还是 Muts 其在对数期增 殖一倍的时间大约为 2h。Mut+ 和 Muts 菌株在没有甲醇存在的情况下生长速率 是一样的，存在甲醇的情况下， Mut+在对数期增殖一倍的时间大约为 4 至 6 个 小时， Muts 在对数期增殖一倍的时间大约为 18 个小时。 菌株 GS 115、X- 33 、KM71 和 SMD1168 的区别 GS 115、KM71 和 SMD1168等是用于表达外源蛋白的毕赤酵母受体菌，与酿酒 酵母相比，毕赤酵母不会使蛋白过糖基化，糖基化后有利于蛋白的溶解或形成 正确的折叠结构。 GS 115、KM 71 、SMD1168在组氨酸脱氢酶位点 (His4)有突变，是组氨酸缺陷型，如果表 达载体上携带有组氨酸基因，可补偿宿主菌的组氨酸缺陷，因此可以在不含组 氨酸的培养基上筛选转化子。这些受体菌自发突变为组氨酸野生型的概率一般 低于 10-8。GS115表型为 Mut+ ，重组表达载体转化 GS115后，长出的转化子可 1 / 6 能是 Mut+ ，也可能是 Muts(载体取代 AXO1基因 ) ，可以在 MM 和 MD 培养基上 鉴定表型。 SMD1168和 GS115类似，但 SMD1168基因组中的 Pep4基因发生突 变，是蛋白酶缺陷型，可降低蛋白酶对外源蛋白的降解作用。 其中 X-33 由于是野生型，因此耐受性比较好，如果担心转化率的话可以考 虑这种酵母菌，而 X33 与 GS115一样都是属于 MUT＋表现型，也就是说可以在 含甲醇的培养基中快速生长，但是据说会对外源基因表达有影响， KM71 的亲本 菌在精氨酸琥珀酸裂解酶基因 (arg4)有突变，在不含精氨酸的培养基中不能生 长。用野生型 ARG4基因 (约 2kb)插入到克隆的野生型 AOX1基因的 BamHI(AOX1 基因密码子 )及 SalI(AOX1基因密码子 )位点，取代了 AOX1基因 16-227 密码子， 此结构转化至 KM71 亲本菌 (arg4his4)中，分离产生 KM71MutsArg+His-菌株， Arg+转化子遗传分析显示野生型 AOX1被 aox1:: ARG4结构所取代，所以 KM71 所有转化子都是 Muts 表型。 AOX1位点没有 被完全缺失，理论上可用你的目的结构通过基因取代方法替换