植物细胞组织和器官超低温保存.ppt

植物细胞组织和器官超低温保存; 第一节 园艺植物种质资源离体保留 种质保留（germplasm conservation）是指利用天然或人工发明适宜环境保留种质资源, 使个体中所含遗传物质保持其遗传完整性和较高活力, 并能经过繁殖将其遗传性传输下去。 ;种质资源保留;一、限制生长保留 限制生长保留（restricting conservation）是指改变培养物生长外界环境条件, 限制离体保留材料生长速度, 使细胞生长降至最小程度, 但不死亡, 从而达成延长继代培养时间目。 现在使用较多限制细胞生长方法有改???培养环境（如降低培养温度、降低培养瓶内氧气含量、降低光照等）、提升培养基渗透压、加入生长抑制剂、饥饿法、失水干燥保留等。;低温保留 低温保留又称微生长保留或最小生长法, 是利用植物生命活动伴随温度降低而减弱甚至几乎完全停止原理, 将外植体在低温条件下, 结合其她不适合生长环境条件, 从而抑制或延缓离体培养物生长和发育, 延长寿命、达成种质保留目。 低温保留种质常见温度范围有3种: 常温（ 20 ±5℃ ）、常低温（0～15 ℃）、低温（-80～0 ℃）。 低温保留是种质资源短期和中期保留常见方法。 关键适用再生植株、分生组织培养物保留;2. 干燥保留 将愈伤组织或体细胞胚等培养物, 合适干燥失水, 移入适宜低温下, 可成功保留种质。 （1）预处理: 将蔗糖浓度增至0.15mol/L或更高, 预处理12-20d。 （2）干燥: 包含胶囊化处理（encapasulation treatment）和脱水处理（desiccation treatment）等方法。 （3）储藏: 通常选择0℃以上低温, 或室温储藏。;3. 生长抑制保留 采取生长抑制剂或生长延缓剂延缓培养物生长, 延长保留时间。 如采取3mg/LABA使草莓试管苗在25±1℃常温下保留12个月, 存活率62.5%; 延长5个月保留时间。在6±2℃保留15个月, 存活率100%。 常见生长延缓剂有ABA、多效唑（PP333）、矮壮素（CCC）和比久(B9)和生长抑制剂三碘苯甲酸（TIBA）、烯效唑（S-3307）和青鲜素（MH）等。;4. 高渗透压保留 提升培养基渗透压能够一直培养材料生长。如在培养基中添加渗透化合物, 如高浓度蔗糖、甘露醇、山梨醇等。 蔗糖浓度由3%提升到10%左右, 可显著抑制培养物生长。;二、超低温保留 超低温保留是指在-80℃至-196℃甚至更低温度下进行生物材料保留。在超低温环境下, 植物活细胞代谢和生长几乎完全停止, 植物处于相对稳定状态, 但能保持正常活性和形态发生能力, 从而达成长久保留目, 在适宜条件下可快速繁殖, 再生出新植株, 并保持原来遗传特征。 ;保持细胞培养物遗传稳定性; 2. 长久保留植物种质资源; 长久保留农作物优良品种及其育种亲本材料种质; 建立长久保留茎尖分生组织种质库及无病毒原种; 5 . 保留试验材料, 预防再培养中遗传变异。;（一）超低温保留原理 ; 冷冻保留是将体外培养物或生物活性材料悬浮在加有或不加冷冻保护剂溶液中, 以一定冷冻速率降至零下某一温度（通常是低于-800C超低温条件）, 并在此温度下对其长久保留过程。 而复苏是以一定复温速率将冻存体外培养物或生物活性材料恢复到常温过程。不管是微生物、动物细胞、植物细胞还是体外培养器官都能够进行冻存, 并在合适条件下复苏。 ; 水在低于零度条件下会结冰。假如将细胞悬浮在纯水中, 伴随温度降低, 细胞内外水分都会结冰, 所形成冰晶会造成细胞膜和细胞器破坏而引发细胞死亡。这种因细胞内部结冰而造成细胞损伤称为细胞内冰晶损伤。; 假如将细胞悬浮在溶液中, 伴随温度降低, 细胞外部水分会首先结冰, 从而使得未结冰溶液中电解质浓度升高。假如将细胞暴露在这么高溶质溶液中且时间过长, 细胞膜上脂质分子会受到损坏, 细胞便发生渗漏, 在复温时, 大量水分会所以进入细胞内, 造成细胞死亡。这种因保留溶液中溶质浓度升高而造成细胞损伤称为溶质损伤或称溶液损伤。; 当温度深入下降, 细胞内外都结冰, 产生冰晶损伤。不过假如在溶液中加入冷冻保护剂, 则可保护细胞免受溶质损伤和冰晶损伤。因为冷冻保护剂轻易同溶液中水分子结合, 从而降低冰点, 降低冰晶形成, 而且经过其摩尔浓度降低未结冰溶液中电解质浓度, 使细胞免受溶质损伤, 细胞得以在超低温条件下保留。; 在复苏时, 通常以很快速度升温, 1-2分钟内即恢复到常温, 细胞内外不会重新形成较大冰晶, 也不会暴露在高浓度电解质溶