MTT实验操作流程.pdf

MTT 实验标准操作流程 1. 原理 活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性 MTT 复原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒 〔Formazan 〕并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜〔 DMSO 〕能溶解细胞中的 甲瓒，用酶标仪在 570nm 波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内， MTT 结晶形成的量 与细胞数成正比。根据测得的吸光度值〔即 OD 值〕，来判断活细胞数量， OD 值越大，细胞 活性越强〔如果是测药物毒性，那么表示药物毒性越小〕。 2. 试剂及耗材 CO2 细胞培养箱、生物平安柜、倒置显微镜 、低速离心机、酶标仪、 8道排枪、培养基 胎牛血清 、MTT 、 DMSO 、96孔细胞培养板、胰酶、血细胞计数板 3. 考前须知 MTT 溶液的配制，通常 MTT 配成的终浓度为 5mg/ml, 须用 PBS 或生理盐水做溶剂。 μm过 滤后 4 ℃避光保存两周内，或配制成 5mg/ml 保存在 -20 ℃长期保存，防止反复冻融，小剂量分 装，用避光袋或锡箔纸包住避光以免分解，当 MTT变为灰绿色时不能再用。 DMSO 可以直接溶解，无需配制，使用方便，溶解速度快，但对人体毒性较大，且需去除 原培养液，在去除培养液的过程中，可能会把结晶去掉，导致结果不稳定。 4. 实验步骤： 4.1 细胞标准曲线制作 4.1.1 0.5% 的胰酶消化对数期细胞，待细胞即将脱离皿底时，加少量血清终止反响， 1000r/min ，离心 5min ，吸去上清，将细胞沉淀用培养基吹打混匀，制成细胞悬液，细胞计数 后调整其浓度至 5-10 ×104/ml 。 4.1.2 取4块96孔板，分别标记为 0h 、24h 、48h 、72h ，，每组设置 3个复孔， 每孔参加 100 μL . 细胞悬液，每板分别铺 8组细胞，分别为 3000 、4000 、5000 、6000 、7000 、8000 、9000 、 10000 个/ 孔，边缘孔用无菌 PBS 填充以消除边缘效应。 4.1.3 5%CO2 ，37 ℃培养箱继续培养，每 24 h 取出一块 96孔板检测： a) 每孔参加 10 μL MTT溶液〔 5mg/ml 〕，继续细胞培养箱培养 4-6h ； b) 小心吸去孔内培养液； c) 每孔参加 150 μL DMSO，使结晶物充分溶解； d) 加 DMSO 后 10min 内，用酶标仪检测各孔波长 μl570nm 的吸光值； 4.1.4 标准曲线制作 以时间为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制细胞增殖标准曲线。选择适宜的细胞浓度进行实验。 4.2 MTT 药物毒性实验步骤 4.2.1 0.5% 的胰酶消化对数期细胞， 加少量血清终止反响， 1000r/min ，离心 5min ，吸去上清， 将细胞沉淀用培养基吹打混匀，制成细胞悬液，细胞计数后调整其浓度至 5-10 ×104/ml ，药物 毒性实验一般每孔细胞数量 5000 — 10000 个〔具体数目根据预实验判断〕。此外，还应根据 细胞本身特性，如生长快慢，来决定细胞数量。比方：生长较快的细胞密度可略小。 4 将细胞悬液制备好后，轻轻混匀，每孔参加 90 μl 细胞悬液 , 这样待测细胞的密度为 5000 — 10000/ 孔〔边缘孔用无菌 PBS 填充〕。 注意： 因细胞在混匀后仍要继续沉降， 因此接种的过程中要反复屡次混匀， 如每加 5 个孔就混 匀一次，以确保接种的细胞密℃在各孔之间完全相同，这对于 MTT 的结果至关重要。 4 5%CO2 ，37 ℃培养箱继续培养， 待细胞单层铺满孔底 〔96 孔平底板〕 ,参加浓度梯