结构化学实验-itc等温量热滴定参照.pdf

一、实验目的： 1. 了解 MicroCal iTC200 等温滴定量热仪在测量蛋白质相互作用中的应用 2. 了解仪器基本工作原理，学习蛋白质相互作用的测定步骤和仪器操作 3. 简要分析实验结果。 二、实验原理： 在研究两种或两种以上的蛋白质的功能时， 相关蛋白质之间常常存在相互作用 （常常是氢键 或范德华力） ，如果两蛋白可以彼此结合，则结合的过程中会放出一定的热量。所以，通过 测定蛋白质相互作用时放出热量的大小，可以得到蛋白相互作用时的结合常数 KD、化学计 量比 N 和焓变 ΔH，从而由热力学公式 ΔG = RT lnKD 和 ΔG = ΔH -T ΔS 可以进一步得到 反应的自由能变化。 在恒温下， 注射器中的 “配体”溶液滴定到包含 “高分子”溶液的池中。 当配体注射到池中， 两种物质相互作用， 释放或吸收的热量与结合量成正比。 当池中的高分子被配体饱和时， 热 量信号减弱，直到只观察到稀释的背景热量。 MicroCal iTC200 等温滴定量热仪可以用来定量测定生物分子间的相互作用，例如蛋白质 - 蛋白质相互作用 （包括抗原- 抗体相互作用和分子伴侣 - 底物相互作用） ；蛋白质折叠 / 去折叠； 蛋白质 - 小分子相互作用以及酶 - 抑制剂相互作用； 酶促反应动力学 ；药物 -DNA/RNA 相互作 用； RNA 折叠；蛋白质 - 核酸相互作用；核酸 - 小分子相互作用；核酸 - 核酸相互作用；生物 分子 - 细胞相互作用等。从而获得亲和力以及相关热力学数据。 通过滴定操作和热量的测量，量热仪可以给出热量 - 摩尔比曲线： 图像中曲线的突跃中点对应的化学计量比就是两种蛋白质相互作用的化学计量数 N，突跃中 点处曲线的斜率就是两种蛋白相互作用的结合常数 KD。 决定曲线形状的主要参数是 C值： C = 滴定池中的蛋白浓度 / KD = [M]t/ KD × N C值越大，曲线越陡； C 值越小，曲线越平缓，没有明显的突跃。一般 C 值在 10-100 之间实 验效果最好。 配体溶液多次次注射到 ITC 池的蛋白溶液中。 每个注射峰下方的区域的面积与注射所释放的 总热量相等。 当这种综合的热量相对添加到池中的配体摩尔比作图时， 就获得了相互作用的 完整结合等温线。用单位点模型来验证数据。化学计量、结合常数及焓的数值都有显示。 三、实验步骤： 1. 清洗样品池和注射池 2. 注射器加样 ①将装有 100 μl 样品的 PE管放入样品管槽； ②将注射器手动移动到“ Rest Position ”，左手转动注射器上端，使注射器的连接孔对准支 架上的孔。 右手将白色细管顶部的连接头水平对准注射器连接孔， 先轻轻将乳白色连接头旋 入连接孔，感到拧到底即可，切记不能拧死，否则注射器会损坏； ③在“ Instrument Control ”界面中点击“ Syringe Fill ”，检查正常后点击 OK； ④将注射器移动到“ Loading Position ”针头插入到试管中，点击 OK，开始吸取样品，待 加满后取下白色细管，放回原位； 3. 样品池加样 ①用玻璃注射器吸取 300 μl 的样品，轻弹注射器壁赶出气泡； ②将注射器对准样品池中间小孔慢慢插入，轻触底部后抬起 1mm； ③用手稳住针筒，缓慢推入样品至样品溢出样品孔，重复吸取赶出样品池中的气泡； ④同样的，在参照池中加入水和 Buffer ； 4. 设置相关的试验参数：总