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第九章聚合酶链式反应及其应用 目 录 PCR技术简史 PCR的原理 PCR的反应体系，方法和特点 常用PCR技术 PCR技术简史 DNA的复制 核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明 PCR技术简史 DNA的复制 核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明 引物酶 引物酶 PCR技术简史 DNA的复制 核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明 DNA 聚合酶 DNA 聚合酶 PCR技术简史 DNA的复制 核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明 PCR技术简史 DNA的复制 核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明 Kary B. Mullis The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction 1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。 引物 引物 Mullis的构思 DNA聚合酶 DNA聚合酶 94℃变性 50-65℃退火 XX℃延伸 94℃ 55℃ 37℃ Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 酶活性(%) 温度(℃) 40 50 60 70 80 90 100 100 80 60 40 20 1988年Saiki开始将耐热性Taq DNA聚合酶应用于PCR 72℃ 94℃ 55℃ PCR循环 目 录 PCR技术简史 PCR的原理 PCR的反应体系，方法和特点 常用PCR技术 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链 与引物复性 DNA变性 形成2条单链 子链延伸 DNA加倍 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 模板DNA PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 引物1 引物2 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 引物1 引物2 Taq酶 Taq酶 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 第1轮结束 第2轮开始 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 Taq Taq Taq Taq PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 第2轮结束 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 模板DNA 第1轮扩增 第2轮扩增 第3轮扩增 第4轮扩增 第5轮扩增 第6轮扩增 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 /v_show/id_XMjMyNzE2NTky.html 目 录 PCR技术简史 PCR的原理 PCR的反应体系,方法和特点 常用PCR技术 标准的PCR反应体系 PE 9600 MJ Research PCR仪 PCR的过程 重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链 与引物复性 DNA变性 形成2条单链 子链延伸 DNA加倍 1）PCR反应成分 （1）模板 单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。 一般100ng DNA模板/100L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。 PCR反应条件 （2）引物浓度 0.1-0.5 mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。 （3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 0.5-2.5 U/50 l 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。 1）PCR反应成分 PCR反应条件 Taq 酶的保真性不高 5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切酶活性，无3’→5’外切活性; 在PCR反应中如发生某些碱基的错配，该酶是没有校正功能的。保真性不如Pfu DNA聚合酶等。 （4）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。 1）PCR反应成分 PCR反应条件 （5） Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。 0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。 Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。 1）PCR反应成分 PCR反