引物合成的详解1引物是如何合成的目前引物合成基本采用固相亚.pdf

引物合成的详解 1.引物是如何合成的？ 目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。 DNA 合成仪有很多种 , 主要都是由 ABI/PE 公 司生产，无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂 消耗量的不同和单个循环用时的多少。 亚磷酰胺三酯法合成 DNA 片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。 亚磷酰胺三酯法是将 DNA 固定在固相载体上完成 DNA 链的合成的， 合成的方向是由待合成 引物的 3 ′端向 5 ′端合成的，相邻的核苷酸通过 3′→5 ′磷酸二酯键连接。 第一步是将预先连接在固相载体 CPG 上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应， 脱去其 5 ′-羟基的保护基团 DMT ，获得游离的 5 ′-羟基。 第二步，合成 DNA 的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚 磷酸活化中间体，它的 3′端被活化， 5 ′-羟基仍然被 DMT 保护，与溶液中游离的 5′-羟基 发生缩合反应。 第三步，带帽 (capping)反应，缩合反应中可能有极少数 5′-羟基没有参加反应 (少于 2%)，用 乙酸酐和 1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。 第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。 经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的 5 ′-羟基上的保护基团 DMT ，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。合成过程 中可以观察 TCA 处理阶段的颜色判定合成效率。 通过氨水高温处理，连接在 CPG 上的引物被切下来，通过 OPC, PAGE 等手段纯化引物，成 品引物用 C18 浓缩 ,脱盐，沉淀。沉淀后的引物用水悬浮，测定 OD260 定量，根据定单要求 分装。 2.引物纯化方式有哪些，如何选择？ ◆ C18 柱脱盐：有人称其为简易反相柱， 它对 DNA 有特异性的吸附， 可以被有机溶解洗脱， 但不会被水洗脱，所以能有效地去除盐分。它不能有效去除比目的片段短的小片段。 实际上， 它是一种脱盐的作用。这种方法一般不会对普通 PCR 反应产生影响。对于需要用于测序、克 隆的引物不能使用这个级别。 ◆ OPC 纯化： OPC 纯化是根据 DNA 保护基 （DMTr 基）和 Cartridge 柱中树脂间的亲合力 作用的原理进行纯化目的 DNA 片段。 OPC 法纯化的 DNA 纯度大于 95%。适用于 40mer 以 下引物的纯化。 ◆ PAGE 纯： PAGE 纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对 DNA 片段进行分离，然后 从凝胶中回收目的 DNA 的方法。 PAGE 纯化法也是一种非常有效的 DNA 纯化方法，纯化后 的 DNA 纯度大于 95%，对长链 Oligo DNA ( 大于 50mer)的纯化特别有效。 ◆ HPLC 纯化： HPLC 纯化是使用高效液相色谱的原理，对 DNA 片段进行纯化。纯度可以 大于 99% 。主要用于短链和修饰引物的纯化。该法的弱点是成本较高，批量生产效率不高。 3.引物的 OD 数如何定量？ 答：引物合成引物 OD 数是这样测定的：用紫外分光光度计，波长 260nm，石英比色杯，光 程为 1 厘米，测定溶液的光密度。测定时溶液的光密度最好稀释到 0.2-1.0 之间。 DNA 干粉 用一定体积的水充分振荡溶解以后，用 1ml 水稀释测 OD 值。需要根据稀释倍数换算出母液 的 OD 值。 4.需要什么级别的引物？ 答：引物常用的纯化方式 C1