质粒DNA提取纯化及验证参照.pdf

山东大学实验报告 2012 年 9 月 26 日 姓名 系年级 10 级生命基地 组别 同组者 科目 分子生物学实验 题目 质粒 DNA 提取、纯化和电泳检测 学号 【实验目的】 1、掌握碱变性提取质粒 DNA法的原理、过程及各种试剂的作用。 2、掌握凝胶电泳对 DNA分离纯化的原理和方法。 【实验原理】 1、提取、纯化质粒 DNA （碱变性提取法） 提取和纯化质粒 DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、 羟基磷灰石柱层析法、 EB一氯化铯密度梯度离心法和 Wizard 法等。其中，碱变 性提取法最为经典和常用， 适于不同量质粒 DNA的提取。该方法操作简单， 易于 操作，一般实验室均可进行。提取的质粒 DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测 定及分析。 碱变性提取质粒 DNA一般包括三个基本步骤： 培养细菌细胞以扩增质 粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒 DNA。 在细菌细胞中， 染色体 DNA以双螺旋结构存在， 质粒 DNA以共价闭合环状形 式存在。细胞破碎后， 染色体 DNA和质粒 DNA均被释放出来， 但是两者变性与复 性所依赖的溶液 pH值不同。在 pH值高达 12．0 的碱性溶液中， 染色体 DNA的氢 键断裂， 双螺旋结构解开而变性； 共价闭合环状质粒 DNA的大部分氢键断裂， 但 两条互补链不完全分离。 当用 pH值 4．6 的 KAc(或 NaAc)高盐溶液调节碱性溶液 至中性时，变性的质粒 DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液 中；但染色体 DNA不能复性，而是与不稳定的大分子 RNA、蛋白质一 SDS复合物 等一起形成缠连的、 可见的白色絮状沉淀。 这种沉淀通过离心， 与复性的溶于溶 液的质粒 DNA分离。溶于上清液的质粒 DNA，可用无水乙醇和盐溶液，使之凝聚 而形成沉淀。由于 DNA与 RNA性质类似，乙醇沉淀 DNA的同时，也伴随着 RNA 沉淀，可利用 RNaseA 将 RNA降解。质粒 DNA溶液中的 RNaseA 以及一些可溶性 蛋白，可通过酚／氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒 DNA。 2 、琼脂糖凝胶电泳 电泳 （electrophoresis) 是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极方向 山东大学实验报告 2012 年 9 月 26 日 姓名 系年级 10 级生命基地 组别 同组者 科目 分子生物学实验 题目 质粒 DNA 提取、纯化和电泳检测 学号 移动的现象。 各种生物大分子在一定条件下， 可以解离成带电荷的离子， 在电场 中会向相反的电极移动。 凝胶是支持电泳介质， 它具有分子筛效应。 含有电解液 的凝胶在电场中， 其中的电离子会发生移动， 移动的速度可因电离子的大小、 形 态及电荷量的不同而有差异。 利用移动速度差异， 就可以区别各种大小不同的分 子。因而，凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化 DNA片段，是分子生物学的核心技 术之一。 凝胶电泳技术操作简单而迅速，分辨率高，分辨范围极广。此外，凝胶中 DNA的位置可以用低浓度荧光插入染料如溴化乙锭 (