生物化学与分子生物学生化试验综合实验qsw.pptx

综合实验人乙醛脱氢酶2 (ALDH2)多态性分析;人乙醛脱氢酶2 (ALDH2)多态性分析;一级结构(串珠样);基因：具有遗传效应的DNA片段，是控制生物性状的基本遗传单位。 基因可以进行自我复制把遗传信息传给下一代，也可以经过转录、翻译等过程是遗传信息得以表达。 基因组：单倍体细胞中包括编码序列和非编码序列在内的全部DNA分子。 基因是遗传信息的携带者与传递者。 基因决定生物的多样性。;基因多态性（Gene polymorphisms）;单核苷酸多态性;基因组多态性的研究的意义;基因组多态性的研究的方法;ALDH2的基因多态性分析;ALDH2的基因多态性分析;实验内容及目的;综合实验分二次完成;综合实验一：基因组DNA抽提及鉴定;方法： 口腔拭子（消毒后的棉签擦拭两侧脸颊各10次） 1. 处理材料： 将在面颊内擦拭过的棉签转置于2ml 离心管中，用剪刀将棉签部分从其杆上剪下，加入400 μl 缓冲液GA。 2. 加入20 μl 蛋白酶K 溶液，涡旋10 秒混匀，56℃放置60 分钟，其间每15 分钟涡旋混匀数次。 ; 3. 加入400 μl 缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10 分钟。此时溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的液滴，用镊子将棉签挤干去除。 4. 加200μl 无水乙醇，充分颠倒混匀，简短离心以去除管盖内壁的液滴。 5. 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CR2 中（吸附柱CR2 放入收集管中），12,000 rpm 离心30 秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR2 放回收集管中。 6. 向吸附柱CR2 中加入500 μl 缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙 醇），12,000 rpm 离心30 秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱 CR2 放回收集管中。 ;7. 向吸附柱CR2 中加入700 μl 漂洗液PW12,000 rpm 离心30 秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR2 放回收集管。 8. 向吸附柱CR2 中加入500 μl 漂洗液PW，12,000 rpm 离心30 秒，倒掉收集管中的废液。 9. 将吸附柱CR2 放回收集管中，12,000 rpm 离心2 分钟，倒掉废 液。将吸附柱CR2 室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。 10. 将吸附柱CR2 转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30μl 洗脱缓冲液TB，室温放置2-5 分钟，12,000 rpm 离心2 分钟。 DNA 产物应保存在-20℃，以防DNA 降解。 ;基因组DNA的鉴定;琼脂糖凝胶电泳定性检测基因组DNA;2、紫外分光光度法定量检测基因组DNA;紫外分光光度法定量检测基因组DNA;注意事项;综合实验二 PCR-APLP PCR产物电泳鉴定及结果分析 ;综合实验;PCR反应液配置;PCR反应条件（DNA扩增仪设定反应条件）;PCR技术;PCR技术简史;;;;;;;;PCR的特点;PCR的反应体系;Taq DNA聚合酶; 引物设计 引物长度以15-40 bp为宜 碱基尽可能随机分布，G+C占50-60% 引物内部避免形成二级结构 两引物间避免有互补序列 ; 模板浓度一般为100ng/100?L,浓度过高会导致反应的非特异性增加。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白。; 引物浓度0.1-0.5 ?mol/L，浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。 Taq DNA聚合酶0.5-2.5 U/50 ?l，酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。; 四种dNTP浓度应相等 Mg2+ 是DNA聚合酶的激活剂0.5mmol/L～2.5mmol/L;循环参数 变性：95oC ，20-30秒。 退火：温度由引物长度和GC含量决定50～60 oC 。 延伸：70-75 oC 循环次数：25-35次。 ;基于PCR的扩增产物长度多态性（PCR-APLP）;ALDH2引物 AL1 5’-TAG GAC ACT CAC AGT TTT CACAT C-3’ (78bp) AL2 5’-CTC TCA CAG TTT TCA CTT T-3’ (73bp) AL3 5’-AAG ATG TCG GGG AGT GG-3’ ; 每个样品;PCR反应液配置;PCR反应条件（DNA扩增仪设定反应条件）;PCR产物电泳鉴定及分析;琼脂糖凝胶电泳Agarose gel electrophoresis;实验原理——琼脂糖凝胶电泳技术;核酸凝胶电泳的基本原理; 1 DNA分子的大小 双链DNA分子迁移的速率与其碱基对数的常用对数近似成反比。 2 琼脂糖浓度