new第7章蛋白质的分离纯化和表征.pptxVIP

2009.7.29;主要介绍蛋白质的分离、纯化的一般原则和方法 分离和纯化蛋白质的各种方法主要是利用蛋白质之间各种特性的差异，包括分子的大小和形状、酸碱性质、溶解度、吸附性质和对配体分子的特异生物学亲和力 ;三、蛋白质相对分子质量的测定;　一、蛋白质的重要性质;1.蛋白质的两性解离性质 ;对某一种蛋白质来说，在某一pH，它所带的正电荷与负电荷恰好相等，也即净电荷为零，这一pH称为蛋白质的等电点(pI)；;没有其他盐类干扰时，蛋白质质子供体基团解离出来的质子数与质子受体基团结合的质子数相等时的pH称为等离子点（isoionic point）;电泳;胶体溶液具有布朗运动、丁达尔现象、电泳现象、不能透过半透膜以及具有吸附能力等特性 ;2. 蛋白质的胶体性质;;3. 蛋白质的沉淀;;沉淀方法类别: 1、高浓度中性盐（盐析、盐溶） 2、酸碱（等电点沉淀） 3、有机溶剂沉淀 4、重金属盐类沉淀 5、生物碱试剂和某些酸类沉淀 6、加热变性沉淀 ;;;水化膜被剥离; 某些物理或化学因素，能够破坏蛋白质的结构状态，引起蛋白质理化性质改变并导致其生理活性丧失。这种现象称为蛋白质的变性 ;4. 蛋白质变性与复性;5. 蛋白质的紫外吸收光谱;6. 蛋白质主要呈色反应;双缩脲反应;Lorry法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。 在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。 Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。;茚三酮反应(ninhydrin reaction) 蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。 ;操作简便快捷，反应非常灵敏，可测定微克级蛋白质含量;二、 蛋白质的分离纯化; 蛋白质纯化的总目标是增加制品的纯度（purity）或比活（specific activity），以增加单位蛋白质重量中所要蛋白质的含量或生物活性（以活力单位数/克蛋白质表示）。 设法除去变性的和不要的蛋白质，并且希望所得蛋白质的产量达到最高值。;（一）透析和超过滤;透析工作图;图 7-6 利用压力和离心力的超过滤;解决的是有或无的问题，未能解决大小的问题！;(二)凝胶过滤——分子排阻;凝胶的交联度或孔度（网孔大小）决定了凝胶的分级分离范围（fractionation range）;分子筛层析;按照分子量大小分离开;在等电时，中性盐（K2SO4)对一氧化碳血红蛋白的溶解度的影响;向蛋白质溶液中加入大量中性盐使蛋白质沉淀称为盐析。;(2) 有机溶剂沉淀法;（四）电 泳;电泳;区带电泳;水平式平板凝胶电泳;垂直式平板凝胶电泳;SDS-凝胶电泳谱;;;等电聚焦（IEF）电泳;毛细管电泳;层析种类： 凝胶过滤（分子筛） 离子交换层析（阴离子和阳离子） 亲和层析;带正电荷多蛋白紧密结合;亲和层析工作示意图;;三、蛋白质相对分子质量的测定;凝胶过滤法测定相对分子质量; 1966年Andrews根据他的实验结果提出了一个经验公式;图7-4 洗脱体积与相对分子质量的关系;洗脱曲线;SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量;SDS;电泳迁移率与多肽链分子量的对数有下列关系;SDS-凝胶电泳谱;四、蛋白质的含量测定与纯度鉴定;若以甘氨酸为例，其反应式如下： ? ? CH2COOH? ? |? ?? ?? ?? ?+ 3H2SO4? ? 2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3? ? (1)? ? NH2? ? 2NH3 + H2SO4??? ?(NH4)2SO4? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ???(2) ? ? (NH4)2SO4 + 2NaOH ? ?2H2O +Na2SO4 + 2NH3? ?? ?? ? (3) ? ?; 反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。 为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。 计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。;2.双缩脲法（Biuret法） 双缩脲（NH3CONHCONH3）是两 个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这