taqmanpcr定量检测人类体液中的弓形虫dna.docxVIP

物中.用Western印迹法检测到微弱的捻转 血矛线虫蛋白带.其表达水平较低。可能因 为虫体蛋白提取制备中捻转血矛线虫蛋白被 稀释,也可能是捻转血矛线虫蛋白的表达对 转基因虫产生毒害。需指出的是?注入结构 并未整合到基因坦中，但作为基因组外序列 保留下来0 本研究显示了秀丽隐杆线虫作为一种载 体来表达寄生线虫候选疫苗抗原的潜力，它 和捻转血矛线虫间的保守程度也确定了秀丽 隐杆线虫作为一种寄生线虫模型的角色。试 验中捻转血矛线虫胃蛋白酶原表达水平不 高.下一步可通过与基因组整合，或改变显微 注射浓度以及应用不同的启动子序列或人工 控制启动子来提高表达水平。捻转血矛线虫 胃蛋白的原在秀丽隐杆线虫成功的表达和其 中类线虫的翻译后加工以及秀附隐杆线虫能 在体外大量培养，表明了它作为寄生线虫基 因表达载体和分析工具的潜力。 (T利摘姜洪杰校) 065对诊断类圆线虫病的Baermann方法 的改进［英］/Francisco H…〃Memo Inst Os- waldo Cruz. —2001,96(6). 一805 ?808 类类圆线虫的感染过去只局限于热带地 区.近年来有扩大的趋势。由于其容易发生 自体感染、慢性感染、二次细菌感染而有很高 的危险性，但其常规的粪便涂片诊断方法敏 感性低?虫体间歇排幼虫的特点又使其诊断 正确率进一步降低，因此?粪类圆线虫的流行 常常被低估。这就需要有更为敏感的诊断方 法。 从粪便中分离线虫幼虫的更为敏感的方 法.有Baermann方法(BM)和琼脂平板培养 法(APC)o前者烦琐，后者简便但价格昂贵. 而旦需要专门技术人员操作(因其有经皮肤 感染的危险)。这两种方法敏感性相近且同 样的费时。BM方法应用更广泛一些，但是 每一标本都需要用漏斗或者烧瓶进行沉淀， 因而操作烦琐.这就限制了它的应用。本文 作者将诊断类圆线虫病的BM方法进行了优 化和改良。 应用6X100 mm的带胶塞的试管取代 带软管的漏斗.在胶塞中央穿孔,插入一个移 液器吸头(Rainin P1000),将少量粪便(2克) 置含8 ml生理盐水的试管中，制成悬液?待 移液器吸头的胶塞封口后，倒置于另一个含 6 ml生理盐水的试管上,37C水浴至少2小 时，然后将第2管离心，光学显微镜下分析沉 淀物。作者收集了 106例嗜酒慢性患者的粪 便标本，在收集标本后的3小时内做改良的 Baermann方法检查.并与标准的BM.ACP 及直接涂片法相比较。标准的及改良的BM 方法在6例患者的炎便中检出类类圆线虫的 幼虫,ACP检出5例.直接涂片法仅检出2 例。在改良的BM法中也检出了微小内蜓阿 米巴和溶组织内阿米巴的包囊。以上结果说 明.改良的BM与标准的BM具有同样的浓 集类圆线虫幼虫的效率.而且改良的方法使 所需空间减少?每一标本的处理仅需试管即 可，在一个标准的试管架上可同时水浴多个 标本.所需粪便量与ACP相似.且更易操作。 幼虫从第1个试管移到第2个试管是由于它 的向温性及重力作用，这也可以解释其同时 检出其他直接涂片法所不能检出寄生虫的原 因。 (马学城摘张维真校) 066 TaqMan PCR定■检测人类体液中的 弓形虫 DNA［英］/Kupferschmidt O…〃Clini Microbiol Inf.—2001,7(3).—120~124 该研究建立一种快速、灵敏的方法.通过 使用弓形虫特异性荧光猝灭探针，以real? time PCR法来检测和定fit弓形虫模板 DNA。此探针是通过引物设计软件设计出 的一段犯基因反义就特异性的序列，含有35 个核昔酸。其说理是:探针首先与弓形虫特 异性引物扩增出的靶序列进行内杂交，然后 由Taq聚合酶5.3核酸外切酶活性在循环 中将其切割为片段，每个片段分别作了荧光 猝灭标记.可在特定的条件下检测出荧光.即 在PCR过程中就可通过观察逐渐明显的荧 光标记而获得靖果.无需等待扩增后再行分 析。研究中使用弓形虫18SiDNA.基因特有 引物TGU b和TGHI进行扩增.产生了一段 88 bp的扩增产物。探针与此扩增产物互 补。 实验中以体液DNA抽提试剂食常规提 取体液 DNAo 以 TaqMan real-time PCR 进 行扩增，扩增过程以及扩堵后的荧光检测均 在ABI Prism?7700序列检测系统内进行。 该实验室所使用的弓形虫DNA的同基因骨 储移植患者的EDTA血样均K3骨18移植机 构提供. 为了确定TaqMan法的敏感性.作者将 患者EDTA血样平行10倍稀释，经real-time PCR.可建立一条直线型标准曲线，表明早期 检测的特异性(循环次效)荧光与参加反应的 速殖子数虽有关。以CSF与羊水进行相应 实验可得类似结果。同时作者还运用半巢式 PCR法来验证TaqMan法的敏