生物化学实验蛋白质性质试验PPT课件.ppt

蛋白质的定量分析是生物化学和其它生命学科最常涉及的分析内容，是临床上诊断疾病及检查康复情况的重要指标，也是许多生物制品，药物、食品质量检测的重要指标。 在生化实验中，对样品中的蛋白质进行准确可靠的定量分析，则是经常进行的一项非常重要的工作。 蛋白质是一种十分重要的生物大分子：它的种类很多，结构不均一，分子量又相差很大，功能各异，这样就给建立一个理想而又通用的蛋白质定量分析的方法代来了许多具体的困难。目前测定蛋白质含量的方法有很多种，下面列出根据蛋白质不同性质建立的一些蛋白质测定方法： 物理性质：紫外分光光度法 化学性质：凯氏定氮法、双缩脲法、Lowry 法， BCA法，胶体金法 染色性质：考马氏亮蓝染色法、银染法 其他性质：荧光法 蛋白质不同方法比较 一、实验原理 蛋白质或多肽分子中有带酚基酪氨酸或色氨酸，在碱性条件下，可使酚试剂中的磷钼酸化合物还原成蓝色（生成钼蓝和钨蓝化合物）。蓝色的深浅与蛋白质的含量成正比，可用比色法测定。 此法的特点是灵敏度高，较双缩脲高两个数量级，较紫外法略高，操作稍微麻烦，反应约在15分钟有最大显色，并最少可稳定几个小时，其不足之处是干扰因素较多，有较多种类的物质都会影响测定结果的准确性。 二、实验仪器 1.卵清蛋白片 2.7200分光光度计 3.试管 4.移液管 三、实验试剂 1.Folin-酚试剂A：碱性铜溶液 甲液：取Na2CO32g溶于100ml0.1mol/l氢氧化钠溶液中 乙液：取CuSO4.5H2O晶体0.5g，溶于1%酒石酸钾100ml中。 临用时按甲：乙=50：1混合使用。 2.Folin-酚试剂B：将100g钨酸钠、25g钼酸钠、700ml蒸馏水、50ml85%磷酸继100ml浓盐酸置于1500ml的磨口圆底烧瓶中，充分混匀后，接上磨口冷凝管，回馏10小时，再加入硫酸锂150g，蒸馏水50ml及液溴数滴，开口煮沸15分钟，在通风橱内驱除过量的溴。冷却，稀释至1000ml，过滤，滤液成微绿色，贮于棕色瓶中。临用时，用1mol/l的氢氧化钠溶液滴定，用酚酞作指示剂，根据滴定结果，将试剂稀释至相当于1mol/L的酸。 3.1mg/mL牛血清蛋白液：称取1g牛血清蛋白片溶于0.9%氯化钠溶液中，并稀释至 1000ml 四、实验步骤 1.标准曲线的绘制 取7支干燥的试管，编号，按下表加入试剂，比色后，以光密度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标作图。 2.样品测定 准确吸取样液0.5ml于干燥的试管中，同样按下表加入试剂，测出光密度值后，对照标准曲线求出样液的蛋白质浓度。 【注意事项】 1、Tris缓冲液、蔗糖、硫酸胺、基化物、酚类、柠檬酸以及高浓度的尿素、胍、硫酸钠、三氯乙酸、乙醇、丙酮……等均会干扰Folin-酚反应。 2、当酚试剂加入后，应迅速摇匀（加—管摇一管）以免出现浑浊。 3、由于这种呈色化合物组成尚未确立，它在可见光红外光区呈现较宽吸收峰区。不同实验室选用不同波长，有选用500或 540nm，有选用640nm，700或750nm。选用较高波长，样品呈现较大的光吸收，本实验选用波长640nm。 【思考题】 蛋白质含量测定的方法有哪些，各有什么优缺点？ 下次实验：氨基酸纸层析和维生素C定量测定-2，6，二氯酚靛酚法。 附：标准曲线EXCEL表制作： 1、将浓度和所测OD值输入到EXCEL表中。 2、将数据区域全部选中。 3、点击“图表向导”键。 4、在图标类型中选择“XY散点图”，然后点击第一个图。 5.点击“下一步”。 222.195.234.199/openclass 登录名：自己的学号 密码：自己的学号 大家先把电子版的实验报告作好，然后在周五或周六以后再上传文件 实验报告要求：1目的2原理3实验仪器4实验试剂5实验步骤6实验结果7实验分析 下次实验：血糖的定量测定-folin-wu法 Folin-Wu法 定量测定血糖的含量 　　 1.氧化供能 2.人体的主要组成成分之一 糖蛋白、糖脂、蛋白多糖、核糖；转化成脂肪和某些非必需氨基酸等 3.糖代谢紊乱→供能障碍→一系列代谢变化 糖的重要生理功能： 血糖及血糖水平的概念： 血糖：指血液中的单糖：葡萄糖 血糖水平：血浆中葡萄糖浓度 血糖总维持在恒定水平：3.9∽6.7mmol/L  血糖的来源和去路 血糖测定的目的和意义 临床：血糖检测是目前诊断糖代谢异常相关疾病的主要依据。 科研：在代谢疾病的研究中，常测定血糖。在某些药物的研究中，也涉及血糖的测定。 调节血糖水平的激素：胰岛素、胰高血糖素、糖皮质激素和肾上腺素。 血糖水平异常：⑴高血糖及糖尿病；⑵低血糖 高血糖症：指空腹血糖浓