β细辛醚对缺血再灌注损伤心肌细胞的保护作用临床医学.docVIP

β细辛醚对缺血再灌注损伤心肌细胞的保护作用临床医学 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：β细辛醚对缺血再灌注损伤心肌细胞的保护作用临床医学 1 1 材料与方法 2 2 结果 4 3 讨论 6 文2：关于β细辛醚对缺血再灌注损伤心肌细胞的保护作用 7 1 实验材料 7 2 实验方法 8 3 结果 10 4 讨论 11 参考文摘引言： 12 原创性声明（模板） 13 文章致谢（模板） 14 正文 β细辛醚对缺血再灌注损伤心肌细胞的保护作用临床医学 文1：β细辛醚对缺血再灌注损伤心肌细胞的保护作用临床医学 石菖蒲是 治疗 心脑血管病的常用药，前期研究表明石菖蒲挥发油对心脑血管系统有明显的保护作用，β细辛醚是挥发油中含量最高的主要有效成分，具有抗缺氧、抗心肌缺血、改善血液流变性和血小板聚集性、降血脂[1-3] 、扩张冠状动脉[4]等多种药理作用。本研究采用原代培养乳鼠心肌细胞观察β细辛醚对缺血-再灌注损伤(MIRI)心肌细胞的保护作用并探讨其作用机理。现报道如下。 1 材料与方法 药品和试剂 β细辛醚由石菖蒲挥发油精制而成〔经气-质联用(GCMS)检测纯度为%)〕，广州中医药大学第一附属 医院 实验中心提供，临用前用吐温80、甘油助溶配成溶液使用;连二亚硫酸钠(天津市福晨化学试剂厂);/L胰酶、高糖DMEM粉剂培养基(GIBCO公司);新生牛血清(TBD公司);5溴2脱氧尿苷(brdu)、二甲基亚砜(DMSO)(Sigma公司);四甲基偶氮唑盐(MTT，广州威佳科技有限公司);罗丹明123(ALEXIS CORPORATION公司);乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)试剂盒(南京建成生物工程研究所) 动物 出生24h以内的SD乳鼠由广州中医药大学实验动物中心提供，合格证号： 主要仪器 5400型CO2培养箱(美国NAPCO公司);LX50/LX70型倒置显微镜(日本OLYMPUS公司);BIORAD550型酶标仪(日本);6010型紫外/可见分光光度计(惠普上海分析仪器有限公司);ALTRA型流式细胞仪(美国BECKMAN COULTE公司，配套EXPO32采集分析软件) 乳鼠心肌细胞的分离培养 取出生24h以内的SD乳鼠，体积分数75%酒精消毒后，取出心脏，用预冷磷酸盐缓冲液(PBS)反复清洗3次，剪成3mm3大小的块状，放入小瓶子中，加入/L胰蛋白酶，4℃放置16h。取出，小心去除胰酶，重新加入/L胰酶，37℃放置20min，DISEASE MODELS，ANIMAL; MICE 加入含体积分数10%新生牛血清的DMEM培养基终止消化，用吸管轻轻吹打至组织完全散开。100目钢筛过滤细胞悬液，滤液收集于10mL刻度离心管中，离心去上清。细胞接种于培养瓶中，置37℃、体积分数5%CO2培养箱中培养。2h后以差速贴壁分离法纯化细胞，然后按1×106个/mL的浓度接种于培养板中。置37℃、体积分数5%CO2培养箱中培养，每24h更换1次培养液，前3d加入溴脱氧尿嘧啶核苷(brdU)抑制成纤维细胞分裂增生，培养3～5d待实验。 实验分组及MIRI模型制备 实验分为6组：正常对照组心肌细胞不做任何处理，按正常条件培养;MIRI模型组将细胞按照模型制备方法处理;给药组(β细辛醚高、中、低剂量组)心肌细胞再灌注时将缺血液换成含β细辛醚(终浓度分别为25、、μg/mL)的培养液作用18h;基质组心肌细胞再灌注时将缺血液换成含基质(吐温80、甘油)的培养液作用18h。 模型制备[5]:采用PBS+化学缺氧剂(Na2S2O4)复制缺血模型。配制终浓度为1mmol/LNa2S2O4的PBS液为缺血溶液(临用时配制，避光)。造模时将正常的细胞培养液换成缺血液，CO2培养箱中孵育2h，造成细胞缺血。再将缺血液换成正常培养液孵育18h，造成再灌注损伤，之后立即收集细胞进行相关实验。 细胞形态学观察 用倒置显微镜观察心肌细胞生长及病变情况。 MTT法检测MIRI心肌细胞存活率 心肌细胞悬液接种到96 孔板，每孔100μL，待细胞贴壁后，按方法分组及处理后，每孔加入10μL MTT (5g/L) ，置37℃、体积分数5%CO2培养箱作用4h，小心吸细胞上清液，加入150μLDMSO裂解，置微量振荡器振荡10min，待孔内颗粒完全溶解后，在酶联免疫仪上于570nm波长处测定各孔吸光度(D) 培养液中乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)的含量测定 将心肌细胞悬液接种到24孔板，每孔1mL，待细胞贴壁后，按方法分组及处理后，取其培养液，根据试剂盒操作步骤测定LDH、CK的含量。 流式细胞术(FCM