不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳.ppt

第一页，共11页 实验原理 电泳：带电粒子在电场中泳动的现象。 泳动的速度取决于粒子带电的多少、分子的大小和形状 聚丙烯酰胺凝胶电泳：被电泳的物质 在聚丙烯酰胺凝胶中电泳，分出的组分形成不连续的圆盘形区带。 聚丙烯酰胺凝胶电泳具有电泳和分子筛的双重作用。 第二页，共11页 不连续体系：凝胶孔径大小不连续 缓冲溶液成分和 pH 不连续 电场中形成电位梯度不连续 样品在浓缩胶中，浓缩成很薄的区带，通过3个物理效应，进行电泳分离。 3个物理效应：浓缩效应、电荷效应、 分子筛效应 实验原理 小分子蛋白质在前，大分子蛋白质在后 电荷多蛋白质在前，电荷少蛋白质在后 第三页，共11页 操 作 步 骤 一、制备凝胶 玻管直径0.6cm，长10cm。底部用白色胶塞封口，中间用绿色胶塞固定 1. 分离胶：过硫酸铵-TEMED系统，化学聚合 依次加入 A:C:H:G 20mL →轻搅匀→ 2 4 4 10 mL 沿管壁滴入封顶液X 3滴 →15-20分成胶 → 甩去封顶掖 (底部~绿胶塞顶部7cm） 沿玻管壁加至绿胶塞顶部高度→ 第四页，共11页 2. 浓缩胶：核黄素-TEMED系统，光聚合 依次加入 B:D:E:F 8mL →轻搅匀 → 1cm/管 1 2 1 4 mL → 封顶液X 3滴 → 垂直放入圆盘电泳仪孔中 → 紫外线照射5-10分成胶 → 甩去封顶掖 电极缓冲液 浓缩胶 1cm 分离胶 7cm 操 作 步 骤 样品 绿色胶塞 上电泳槽 下电泳槽 电极缓冲液 第五页，共11页 二、安装凝胶管 1. 去除白胶塞，将凝胶小玻管依次垂直安装 注意：不能漏水，上槽先加少许缓冲液M检漏 三、加样 样品处理：血清(生理盐水稀释)+甘油+溴酚蓝 加样：微量加样器沿壁加样100微升 操 作 步 骤 2. 电泳仪下槽加电极缓冲液，应浸没下槽 在电泳仪上槽小孔内, 塞紧绿胶塞。 中的电极及小玻管的下端 第六页，共11页 操 作 步 骤 四、加电极缓冲液 1. 玻管凝胶样品上方，电极缓冲液M沿壁缓慢 2. 上槽加电极缓冲液M浸没玻管顶部及 加入，封满玻管 圆盘电泳仪盖上的电极 第七页，共11页 操 作 步 骤 五、通电 电泳时间1小时 → 绿胶塞下出现染料蓝色带 → 关电泳仪开关 →拔电源插头 →取下电极线 →取玻管→ 倒去上槽中的缓冲液 通直流电. 恒流 接电极线 红A黑 红B黑 + - 下槽 上槽 电压180-400v（自动，不用调） 3mA/管，3×12管=36mA 3×24管=72mA 一拖二 600v 100mA 恒流 开 推进 推进 不推 推进 调整 调整mA →36 mA/72mA 电泳仪 第八页，共11页