ELISA、western blot、免疫组化、RT-PCR实验方法原理及其在SCI论文材料方法、结果中的写作.ppt

* 1. 抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，并保持其免疫学活性。 2. 抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性。（HRP） 3. 酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，由此进行定性或定量分析 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * SP三步法 免疫组化 脱蜡与水化 2.细胞通透、封闭内源性过氧化物酶 抗原修复、暴露抗原决定簇 封闭非特异性蛋白 一抗孵育 生物素标记的二抗二抗孵育 SP(链霉亲和素-过氧化物酶) 反应 显色 复染、脱水、透明、封片 细胞通透、封闭内源性过氧化物酶 ABC法基础上的进一步改良，使卵白素与链霉（而非生物素）结合。 灵敏特异性低，成本低。 第六十二页，编辑于星期二：十三点 三十分。 结果分析 免疫组化 阳性着色细胞计数法：在40*光镜下，随机选择不重叠的10个视野，人工或机器计数阳性着色细胞，每组3~6张不同动物组织切片，然后进行组间比较即可。 Melatonin：褪黑素 Hy: hypoxia缺氧 Nestlin: 巢蛋白，特异性的表达在神经上皮干细胞 神经干细胞增殖分化 Journal of Pineal Research IF = 7.812 第六十三页，编辑于星期二：十三点 三十分。 结果分析 免疫组化 灰密度分析法：通过在不同组别和不同动物组织切片上选择相同区域、相同条件下用Image pro plus进行灰密度分析，然后进行统计分析即可。 第六十四页，编辑于星期二：十三点 三十分。 结果分析 免疫组化 评分法：通过在光学显微镜下对组织切片分别按染色程度（0~3分为阴性着色、淡黄色、浅褐色、深褐色）、阳性范围进行评分（1~4分为0~25%、26~50%、51~75%、76~100%），最终可以分数相加，再进行比较。 相同曝光时间、相同显色时间 大体分为阴性、弱阳性、阳性 B D C A E F G H Ⅱ Ⅲ Ⅳ Normal 第六十五页，编辑于星期二：十三点 三十分。 常见问题分析 免疫组化 原因? 解决办法 抗体的浓度过高或抗体孵育时间过长 降低抗体滴度（一般指浓缩性抗体）抗体孵育时间：室温1小时或4℃过夜 孵育温度过高，孵育温度超过37℃ 一般室温20-28℃ DAB显色时间过长或DAB浓度过高 显色时间不能超过5-10分钟，以显微镜下观察为准 染色过强 第六十六页，编辑于星期二：十三点 三十分。 常见问题分析 免疫组化 染色弱 原因 解决办法 抗体浓度过低，孵育时间过短 提高抗体浓度，孵育时间不能少于60分钟 试剂超过有效使用期 及时更换试剂 操作中，滴加试剂时缓冲液未沥干，致使试剂稀释 每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液（但防止切片干燥） 室温太低，低于15℃ 若室温低于15度，要改放在37℃孵育箱孵育30-60分钟（或4℃冰箱过夜） 蛋白封闭过度 封闭时间不要超过10分钟 第六十七页，编辑于星期二：十三点 三十分。 常见问题分析 免疫组化 染色阴性 原因 解决办法 操作步骤错误 重新试验，设立阳性对照 组织中无抗原? 设立阳性对照片，以验证实验结果 一抗与二抗种属连接错误 仔细确定一抗与二抗种属无误 第六十八页，编辑于星期二：十三点 三十分。 常见问题分析 免疫组化 非特异性背景染色 原因 解决办法 操作过程中冲洗不充分 每步冲洗3×5 组织中含过氧化物酶未阻断 可再配置新鲜3%H2O2封闭，孵育时间延长 组织中含内源性生物素? 正常非免疫动物血清再封闭 血清蛋白封闭不充分 延长血清蛋白封闭时间 第六十九页，编辑于星期二：十三点 三十分。 写作实例 免疫组化 IF = 1.959 第七十页，编辑于星期二：十三点 三十分。 写作实例 免疫组化 IF = 5.006 第七十一页，编辑于星期二：十三点 三十分。 写作实例 免疫组化 ?IF = 3.534 第七十二页，编辑于星期二：十三点 三十分。 写作实例 免疫组化 ?IF = 3.534 第七十三页，编辑于星期二：十三点 三十分。 Real Time PCR 几个概念 Real Time PCR定义 应用 原理 结果分析 写作实例 第七十四页，编辑于星期二：十三点 三十分。 Real Time PCR 几个概念 PCR，RT-PCR，Real Time PCR，qPCR PCR：Polymerase Chain