106肽图方法验证方案20120801.doc

注射用重组人白细胞介素-1受体拮抗剂原液肽图检测方法验证方案 The Method Validation Protocol Of Recombinant Human Interleukin-1 Receptor Antagonist Bulk Peptide Map Analysis 编号 No.：MVP-12-010 第 PAGE 7 页 共 7 页 起草人/日期Prepared by /Date： 审核人 部门 日期 批准人/日期Approved by/Date： 目 录 TOC \o 1-1 \h \z \u 一、目的： 3 二、范围： 3 三、责任： 3 四、分析方法描述： 3 五、方案培训： 4 六、验证内容： 4 十、缩写与定义： 6 十一、参考文件： 6 十二、附件： 6 一、目的： 1. 证明该方法适用注射用重组人白细胞介素-1受体拮抗剂原液肽图的测定。 2. 验证注射用重组人白细胞介素-1受体拮抗剂原液肽图方法的可靠性和有效性。 二、范围： 1. 适用于注射用重组人白细胞介素-1受体拮抗剂原液肽图分析方法验证。 三、责任： 部门 职责 QC 负责方法验证方案的起草，验证有关的培训，分析仪器的操作及原始数据的记录，起草验证报告。 QC经理负责方法验证方案和报告的审核，协调指导该项验证工作。 QA 负责审核验证方案和验证报告，组织开展验证工作，协调验证实施。 QA经理负责方法验证方案、报告的审核。 负责验证文件的保存归档。 质量管理负责人负责方法验证方案和报告的批准。 四、分析方法描述： 1. 样品处理 1.1样品稀释 取注射用重组人白细胞介素-1受体拮抗剂理化对照品和样品原液，分别精密量取适量，用超纯水稀释至1.0mg/ml。 1.2 透析 分别精密量取超纯水、稀释好的理化对照品溶液和样品溶液各400μl（相当于蛋白含量0.4mg）置处理过的透析袋中，置大体积1%碳酸氢铵溶液中透析24h后，收集透析袋中溶液。 1.3 消化 在上述收集的溶液中分别加入8μl 0.1mg/ml的TPCK处理的胰蛋白酶，在37℃水浴中消化24h。 1.4 终止消化 各加入40μl 50%醋酸溶液，终止消化。10000r/min离心5min，取上清。 2. 色谱条件 2.1 仪器：HPLC仪（四元泵，UV Detector） 2.2 色谱柱：Waters Symmetry300 C18 5μm 4.6*250mm 2.3 柱温：30℃ 2.4 波长：214nm 2.5流速：1.0ml/min 2.6 进样量：100μl 2.7 进样温度：4℃ 2.8 流动相：A：0.1%TFA-H2O B：0.1%TFA-ACN，按下表梯度洗脱： Time(min) A (%) B (%) 0 100 0 70 30 70 71 100 0 81 100 0 3. 图谱分析 比较样品与对照品，各色谱峰的保留时间与相对峰面积有无明显差异。 五、方案培训： 1. 验证开始前首先由起草人对相关人员进行方案培训，按照培训管理规程的规定进行记录，并将培训记录的复印件纳入验证报告的附件。 六、验证内容： 1. 相关确认 1.1 仪器确认： 确认相关仪器、设备经过校验，在校验合格期内。记录表格见附件一表1和表2。 1.2 试剂、标准品和样品确认 确认所用试剂、标准品和样品规格和纯度符合要求，在有效期内。记录表格见附件一表3和表4。 1.3 人员培训确认： 确认操作人员接受了高效液相色谱仪方法和肽图检测方法操作培训。 2. 验证程序 项目包括：精密度和专属性 2.1 精密度 2.1.1 重复性 2.1.1.1 目的 考察在规定的测试条件下，同一均匀供试品，经多次处理取样，测定所得结果之间的接近程度。 2.1.1.2方法 2.1.1.2.1样品稀释 取注射用重组人白细胞介素-1受体拮抗剂理化对照品一支，样品原液一批，分别精密量取适量，用超纯水稀释至1.0mg/ml，其中样品原液同法稀释成三个平行样品。 2.1.1.2.2 透析 取超纯水，稀释好的理化对照品溶液和3份样品溶液各400μl，置透析袋（MWCO：14000），在1%碳酸氢铵中透析24h后，收集透析袋中溶液。 2.1.1.2.3 胰蛋白酶消化 在上述收集的溶液中分别加入8μl 0.1mg/ml的TPCK处理的胰蛋白酶溶液，在37℃水浴中消化24h。 2.1.1.2.4 终止消化 各加入40μl 50%醋酸溶液，终止消化。10000r/min离心5min，取上清。 2.1.1.2.5 进样 精密量取上述处理好的超纯水，处理过的理化对照品溶液和样品溶液各100μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。 2.1.1.3可接受标准 同一人做