实验五植物组织中SOD活性测定.docx

实验五 SOD 活性的测定 一、实验目的 学习并掌握氮蓝四唑（ NBT ）法测定植物体内超氧化物歧化酶（ SOD ）活性 的 基本原理和操作方法。 二、实验原理 超氧物歧化酶（ superoxidedismutase SOD ）普遍存在于动、植物体内，是 一 种清除超氧阴离子自由基的酶。测定 SOD 活性的方法很多，简便且常用的是 （氮蓝四唑 ） 光还原法。该方法的原理是超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑 ） 在光下的还原作用来确定酶活性大小。当反应体系中有可被氧化的物质存在时， NBT （NBT 核 黄素可被光还原， 被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生氧气， 氧气 被 单电子还原产生氧自由基， 氧自由基则可将氮蓝四唑还原为蓝色的化合物， 后 者 在 560nm 处有最大吸收。而 SOD 可清除氧自由基，当反应体系中有 SOD 存 在时 可抑制 NBT 的还原，于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈 低，反之 酶活性愈高。因此可通过测定 A560 来计算 SOD 的活性，以抑制 NBT 光还原反应 50% 所需的酶量为一个酶活性单位。 三、实验材料、试剂与仪器 1. 实验材料：小白菜叶片。 2. 实验试剂： （ 1） 0.05mol/L 磷酸缓冲液（ pH7.8 ）； （2） 130mmol/L 甲硫氨酸（ Met ）溶液：称 1.9399gMet 用磷酸缓冲液定容 至 100ml； （3） 750 卩 mol/L 氮蓝四唑（ NBT ）溶液：称取 0.06133gNBT 用磷酸缓冲液 定容至 100ml ，避光保存； （4） 100 卩 mol/LEDTA-Na 2 溶液：称取 0.03721g EDTA-Na 2 用磷酸缓冲 液 定容至 1000ml； （5） 20 卩 mol/L 核黄素溶液： 100 卩 mol/L 核黄素溶液稀释 5 倍即实验所需 的 20 卩 mol/L 核黄素溶液； （6） SOD 提取介质： 50mmol/L 磷酸缓冲液（ pH7.8 ）内含 1% 的聚乙烯吡 咯烷酮（ PVP ）、 3. 实验仪器： 高速台式离心机，可见分光光度计，光照培养箱，专用试管，研钵 等。 四、实验步骤 1、 粗酶液提取 将小白菜叶片放置在冰箱中冷处理 3min ，用作胁迫对照。分别取正常条件 0.530.243 0.5 3 0.243 0.244 0.244 2 0.035 0.034 0.035 和冷害处理的小白菜叶片（去叶脉） 在冰浴上研磨成浆，加缓冲液定容至 清液即为 SOD 粗提液。 2、显色反应 0.5g 于预冷的研钵中， 1ml 预冷的磷酸缓冲 液 10ml 。取 5ml 于 1000rpm 下离心 10min， 上 取透明度好，质地相同的专用试管 4 支， 2 支为测定管，另 2 支为对照管 , 按下 表加入反应显色试剂。 反应试剂（ ml） 0.05mol/ 磷酸缓冲液 130mmol/L Met 溶液 750 卩 mol/L NBT 溶液 100 pmol/L EDTA-Na 2 20 卩 mol/L 核黄素溶液 粗酶液 ( ml) 蒸馏水 (ml) 1 1.5 0.3 0.3 0.3 0.3 0.1 注： 1 表示正常调节的小白菜； 2 表示冷处理的小白 菜； 3 表示光下空白对照； 试管号 2 3 1.5 1.5 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.1 0 0.5 0.5 4 表示暗处理对照 4 （黑暗对 照 1.5 0.3 0.3 0.3 0.3 0 0.5 4 号试管加入核黄素之后立即用黑色布套套住遮光，全部试剂加完后摇匀， 将 试管置于光照培养箱中（使试管尽量靠近灯管），反应温度控制在 后，用暗中对照管调零， 3 号管为光下对照，在 560nm 下测定 吸光度，记录测定数据。 3、结果计算 30C。反应 结束 1~3 号试管反 应液的 SOD 活性（ U/gFW h_1） = （A°-As） A/t 60/