生化实验2酶促反应动力学马.pptx

1 2 等 酶联免疫 离心 生化实验课的主要特点 分子 生物学技术 电泳 层析 光学检测 生化实验的基本内容 生化 实验 生化实验课的目的性 3 实验本身: 实验室规则: 时间、穿着、仪器不能乱动、赔偿制度、卫生整理。 预习报告、规范操作（辨认标签等）、如实记录、污染物、毒物、废弃物等（大量自来水冲洗） 实验 4 酶促反应动力学实验 主讲：马颖哲 5  实验目的 分光光度法及比色分析法 试管实验的注意事项 酶促反应动力学研究的基本方法 验证酶促反应动力学的部分理论 6 1.分光光度法及比色分析法2.酶促反应及颜色反应 (磷酸苯二钠法)3.酶促反应动力学 实验原理 7 一、分光光度法及比色分析法 分光光度法 分类： 紫外分光光度法 比色分析法 利用吸收光谱的形状和吸收程度的大小可以对物质进行定性和定量的分析。 8 测光机构 光源 单色光器 单色光 散色光 吸收杯 分光光度计的原理 9 Lambert—Beer Law 10 当溶液的厚度不变 对于同一物质和同样波长的单色光，其消光系数不变 溶液的光密度和溶液的浓度成正比(一定浓度范围内) 由D = －Lg I/I0=KCL D1/D2=C1/C2 C1=D1 / D2×C2 Lambert—Beer Law的应用 11 1、开启电源，打开试样室盖，选择开关置于“T”，波长调至测试用波长。仪器预热20分钟。 2、开盖调“0.00”，盖盖 调“100.0”。 （选择开关置于“T”） 分光光度计的使用— 12 分光光度计的使用— 3、吸光度A的测量： 将选择开关置于A，调节吸光度调零旋钮，使数字显示为0.00，然后将被测样品移入光路，显示值即为被测样品的吸光度值。 13 1.比色杯光学表面不能有任何污损，否则会引起光吸收的增加。 3.装液量为2/3左右 ，不能超过2/3,用前润洗。 2.比色杯的外表面应以高质量的柔软擦镜纸或绸布擦干净，不能使用易磨损比色杯的滤纸。 分光光度计的使用—比色杯的使用和清洗 14 二、酶促反应 (磷酸苯二钠法) 底物:磷酸苯二钠 酶:碱性磷酸酶(AKP) 15 磷酸苯二钠 苯 酚 4－氨基安替吡啉 亚醌衍生物 （紫红色） 吸收峰 510nm 酶促反应及颜色反应的全过程 16 三、酶促反应动力学 什么是？研究条件？ 底物浓度对v的影响 pH对v的影响 抑制剂对v的影响 17 底物浓度对v的影响 5个关键词 [S]对V的影响 呈矩形双曲线 米-曼氏方程 双倒数作图法用于Ｋm值与Ｖmax值的测定 双倒数方程/林贝氏方程 中间产物学说 18 pH对v的影响 为什么？ 最适pH (optimum pH) —酶催化活性最大时的环境pH。 19 抑制剂对v的影响 竞 争 性抑制 非竞争性抑制 反竞争性抑制 三种抑制比较 从抑制剂的结构 与酶的结合部位 中间产物学说 Vmax、Km 林-贝氏作图 几方面来分析 20 实验部分 21 操作注意事项 1、试管洗净 2、吸量管使用、准确、无污染 3、可调移液器（枪）使用 4、试剂按表格操作顺序加入、混匀 5、试剂瓶归位 6、测量光密度时速度快 22 加酶液时注意事项 1、快（第一管和最后一管间隔时间不能太长） 2、准（不能加到试管壁上） 3、马上计时 4、混匀 23 试剂 (ml) 1 2 3 4 5 6 不同pH甘氨酸缓冲液 H2O 0.04M基质液 Ph8.0 0.9 ---- 1.0 pH9.0 0.9 ---- 1.0 pH10.0 0.9 ---- 1.0 pH11.0 0.9 ---- 1.0 pH12.0 0.9 ---- 1.0 ---- ---- 0.9 1.0 37水浴5—10分钟 酶液 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 pH8.8Tris缓冲液 0.1 一、磷酸苯二钠法测定AKP的最适pH值 (试剂添加顺序、混匀) 反 应 体 系 24 （加入酶液立即计时，迅速混匀）快，准  37℃ 水浴5—10分钟 加入0.5N NaOH 1.0 ml(终止反应) 加入0.5％铁氰化钾2.0ml，充分混匀 室温放置5-10分钟(根据情况） 加入0.3％4－氨基安替比林1.0ml 510nm比色，测定OD值(6号管校正零点) 25 以pH值为横坐标,OD值为纵坐标绘图, 找出该酶的最适pH. 理想结果 结果处理 26 二．底物浓度对酶促反应速度的影响 酶：碱性磷酸酶 底物：磷酸苯二钠 27 试剂(ml) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0.04M基质液 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.8 1.0 --- pH10碳酸