3章-生态毒理学研究方法.ppt

* (二)基因芯片在毒理学的应用 Nuwaysir等研制出包括涉及细胞凋亡、DNA复制和修复、氧化应激/氧化还原内稳态、过氧化物酶体增殖反应、二恶英/多环芳烃反应、雌激素反应、细胞周期调控、热休克蛋白、受体、细胞色素P450等共2090个基因的毒理芯片，该芯片既可用于有毒污染物质的检测和遗传多态性的检测，又可用于污染物质毒性机制的研究。 * Holden等从人和小鼠基因文库中选择大约600个与毒理学相关基因的cDNA克隆，制备了种属特异的毒理基因学芯片，可研究肝脏毒性、内分泌干扰、致癌作用等毒性终点的作用机制，也可用于确定以基因表达模式为基础的污染物的毒性。 * 五、一般代谢酶的活性测定 (一)乙酰胆碱酯酶活性测定 测定AChE活性最常用的方法是比色法 埃尔曼提供的方法其原理是，由胆碱酯酶水解乙酰胆碱的硫醇同系物而产生硫醇，可与双二硫代硝基苯甲酸(DTNB)起反应，生成—种深黄色的结合物，可在412nm波长处进行比色测量； 另一种比色法是依据与未水解的乙酰胆碱底物形成一种棕色的异羟肟酸铁络合物的原理，于540nm波长处进行比色测定。 * (二)三磷酸腺苦酶活性测定 三磷酸腺苷酶（ATPase）是生物体内重要的酶，存在于所有的细胞中。它在生物体内的作用是水解高能化合物三磷酸腺苷（ATP）而释放出生命活动所需的能量，因而具有重要的生物学意义。 ATPase活性按Matsumura等的方法进行。用钼蓝法测定经酶水解释放的无机磷。 * 六、解毒系统酶类诱导作用的检测 (一)混合功能氧化酶（ MFO）的诱导作用 直接法是直接测定MFO的各组成成分。 代谢法是通过测定MFO催化反应中的底物消耗量或产物生成量。 在生态毒理学中常采用多种检测分析方法，从不同角度进行MFO作用的评定。 * (二)谷胱甘肽硫转移酶 谷胱甘肽硫转移酶（GST）的分布十分广泛，如在哺乳动物、昆虫、鱼、水生无脊椎动物、植物以及细菌中均含此酶。在哺乳动物中，发现肝的可溶部分中GST的浓度最高。 GST具有催化CDNB与GSH相结合的能力，在一定反应时间内，GST活性高低与反应前后底物浓度呈线性关系。 利用紫外分光光度计，测定底物的光密度值 ，可计算出GST的含量。 * 七、抗氧化防御系统检测 (一)过氧化氢酶 1.原理 动、植物和微生物细胞内的过氧化氢酶可催化过 氧化氢分解为水和分子氧 ： 过氧化氢酶 O2+2H2 2H2O2 * 当酶与底物(过氧化氢)反应结束后，再用碘量法测 定未分解的过氧化氢酶。以钼酸铵作催化剂，使过 氧化氢与碘化钾反应，放出游离碘，然后用硫代硫 酸钠滴定碘，其反应为 H202十2KI十H2S04 I2十K2S02十H20 I2十2Na2S203 2NaI十Na2S406 根据被催化分解的H202量，即可计算过氧化氢酶的活性。 * (二)谷胱甘肽过氧化酶(GPx) ①直接法：即直接测定GSH减少量 ，GSH在255nm处呈最大吸收，故可从255nm光吸收减少量计算GSH消耗量，从而判断酶活性。 ②间接法：其原理是利用H202或有机氢过氧化物氧化GSH，同时加入NADPH及谷胱甘肽还原酶，使氧化的GSH重新转变为GSH，NADPH转变为NADP+，测定NADP+在340nm的光吸收即可确定酶活性。 * 八、RAPD技术在DNA损伤检测中的作用 1.原理 在无需知道被研究生物DNA序列的情况下，以一系 列经过优化的寡核苷酸单链为引物，以研究对象的 基因组DNA为模板，如引物与模板的某一片段 DNA具有互补序列，则两者结合，扩增出DNA片 段，反映了基因组相应区域的DNA特性。 * 2.操作步骤 基因组DNA的提取、纯化； 基因组DNA的随机扩增； 扩增产物的电泳； 随机扩增DNA多态性的图像分析。 * 第四节 生物致突变效应检测 一、概 述 二、体外基因突变试验 三、细胞遗传学试验 四、体内基因突变试验 * 一、概 述 致突变试验是为了确定某种或环境污染物对生物体是否具有致突变作用所进行的试验。 致突变试验方法根据终点反应不同，可区分为基因点突变试验、染色体畸变试验和DNA损伤试验等。这些试验有的在体外进行，有的在体内进行，所使用的生物系统包括微生物(细菌，真菌等)、哺乳动物、昆虫乃至植物细胞等。 * 二、体外基因突变试验 (一)鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体试验 又称Ames试验 基本原理：利用一种突变型微生物菌株与被检测化学物质接触，如该化学物具有致突变性，则可使突变型微生物发生回复突变，重新成为野生型微生物。 * ①因突变型菌株不具有合成组氨酸的能力故不能在低营养的培养基(即不含或少含组氨酸的培养基)上生长。 ②野生型菌株具有合成组氨酸的能力可在低营养的培养基上生长，检查所诱发的沙门氏菌回