《生物化学实验》全套课件-PPT.ppt

根据电泳槽膜支架的宽度，裁剪尺寸合适的滤纸条制作滤纸桥 3. 上样： 连接电泳仪和电泳槽 将薄膜毛面朝下，点样端朝向负极置于滤纸桥上（注：不可让点样处接触滤纸桥） 排空膜上的气泡 平衡：盖上电泳槽盖，平衡5min至膜完全湿润 电泳：稳压，110V，约1.5h（至第一条带到达膜条2/3处为止） 4. 电泳： 染色：用镊子将膜条夹至氨基黑10B中染色10min. 注意：薄膜条要完全浸入染色液且每条要分开，不重叠.(染色液回收) 漂洗：染色完毕，将薄膜取出，放入漂洗液中漂洗至背景无色，再浸入蒸馏水中。 5. 染色及漂洗： 注意：漂洗薄膜时，请做到“少量多漂”，即用少量的漂洗液去漂洗薄膜，多漂几次，这样既不浪费漂洗液，还达到了漂洗的效果。 将薄膜用滤纸吸干或吹风机吹干，浸入透明液完全干燥后，薄膜完全透明，可作扫描描或照相，将该玻璃板浸入水中，则透明的薄膜可脱下，吸干水分可长期保存。（不做） 六、透明 五、记录和分析实验结果 漂洗完毕后将薄膜取出, 放在滤纸上。将薄膜上的几条色带根据其颜色深浅、形状、大小及相对位置进行描述、记录在实验报告上，并判断分析其结果。 清蛋白 57.45-71.73% a1-球蛋白 1.76-4.48% a2-球蛋白 4.04-8.28% β-球蛋白 6.79-11.39% γ-球蛋白 11.8522.97% A/G 1.24-2.36 实验结果： 正常参考值： 注 意 事 项： 1、醋酸纤维素薄膜一定要充分浸透后才能点样。点样后电泳槽一定要密闭。电流不宜过大，以防止薄膜干燥，电泳图谱出现条痕。 2、缓冲溶液离子强度不应小于0.05或大于0.07。因为过小可使区带拖尾，过大则使区带过于紧密。 3、电泳槽中缓冲液要保持清洁(数天过滤)两极溶液要交替使用；最好将连接正、负极的线路调换使用。 4、通电过程中，不准取出或放入薄膜。通电完毕后，应先断开电源后再取薄膜，以免触电。 【思考题】 1、影响醋酸纤维薄膜电泳的因素有哪些，其是如何影响的？ 2、实验过程中哪些操作会影响到实验条带的完整性，应该如何改正？ 其他主要电泳技术介绍： 1、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 常用于蛋白质分子量的测定，有垂直板、平板、盘状电泳 2、等电聚焦电泳： 通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质。 3、双向凝胶电泳： 蛋白质组学研究的重要技术。 4、琼脂糖凝胶电泳： 分离DNA或RNA分子 胰蛋白酶活力测定 酶的定义 是一类生物催化剂。 是一类由活细胞产生的，对其特异底物具有高效催化作用的蛋白质。 酶的化学组成 蛋白质部分：酶蛋白 (apoenzyme) 辅助因子 (cofactor) 金属离子 小分子有机化合物 全酶 (holoenzyme) 辅助因子分类 （按其与酶蛋白结合的紧密程度） 辅酶 (coenzyme): 与酶蛋白结合疏松，可用透析或超滤的方法除去。 辅基 (prosthetic group): 与酶蛋白结合紧密，不能用透析或超滤的方法除去。 ????必需基团： 酶分子中与催化作用直接相关、不可缺少的化学基团。 ??活性中心： 酶分子中必需基团相对集中，构成一定空间结构区域，与催化作用直接相关。 ???? 酶的活性中心 活性中心 结合部位 （底物） 催化部位（底物的键在此处被打断或形成新的键） 底 物 活性中心以外的必需基团 结合基团 催化基团 活性中心 酶的活力 酶活力（enzyme activity）：是指酶催化一定化学反应的能力。 酶活力单位（国际单位）：标准状态下，每分钟使一微克分子作用物发生转变的酶量。人们普遍 采用是习惯用法，如a-淀粉酶，可用每小时催化1克可溶性淀粉所需要的酶量来表示。 福林—酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸，在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原为蓝色化合物（钨蓝和钼蓝）。 蛋白质中含具酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），用胰蛋白酶水解蛋白底物，生成含酚基的氨基酸与福林—酚试剂反应，生成蓝色化合物，在一定的范围内，蓝色化合物颜色的深浅与酶活力的大小成正比。 一、实验原理 试管 7200分光光度计 恒温水浴锅 二、实验仪器 福林试剂B：见福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度部分(冰箱中) 0.55mol/L碳酸钠溶液：58.3g无水碳酸钠溶于蒸馏水，稀释并定容至1000ml 10%三氯乙酸溶液 0. 2mol/L磷酸缓冲液(pH7.5)： 0.5% 酪素溶液：称取0.5g酪素，以0.5mol/L氢氧化钠1m