铁死亡的研究方案及详细思路.docx

铁死亡的研究方案及详细思路 一、铁死亡简介 铁死亡（Ferroptosis）最早是 2012 年由 Brent R. Stockwell提出的[1]，研究发现 Erastin 可以特异性诱导 Ras 突变细胞死亡，但是没有典型的细胞凋亡特征，铁螯合剂可以抑制这一过程，并且另一种化合物 RSL3 也有类似的细胞死亡表型[2, 3]。与经典的细胞凋亡不同，铁死亡过程中没有细胞皱缩，染色质凝集等现象，但会出现线粒体皱缩，脂质过氧化增加。传统的细胞凋亡，细胞自噬，细胞焦亡的抑制剂不能抑制铁死亡过程，但铁离子螯合剂可以抑制这一过程，说明铁死亡是铁离子依赖的过程。 基础研究中经常涉及到对多种细胞死亡方式的研究，如细胞自噬、凋亡、焦亡等。细胞铁死亡是最近几年才被发现的一种细胞死亡方式， 目前对它的形态学、生物学、机制通路有了部分了解，但铁死亡过程涉及多种机制，受到信号通路的精密调控，铁死亡与疾病的发生有何种联系，是否与其他细胞死亡方式联合介导疾病的进展，因此，进一步深入研究铁死亡的作用机理，研究其在不同疾病类型中的作用，对寻找相关疾病的治疗靶点、靶向药物的研发具有重要意义。 铁死亡相关特征 形态学特征：超微结构显示，铁死亡时细胞膜断裂和出泡，线粒体萎缩、线粒体脊减少甚至消失、膜密度增加、细胞核形态正常， 但缺乏染色质凝集；电镜下观察到胞内线粒体变小、双层膜密度增高。 生物学特征：活性氧（ROS）增加、铁离子聚集，激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）系统，通过降低胱氨酸的摄取、耗竭谷胱甘肽，抑制 ystem Xc-和增加还原型酰腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶，释放花生四烯酸等介质。 （ 3 ） 免 疫 学 特 征 为 损 伤 相 关 分 子 模 式 （ damage- associatedmolecular patterns molecules，DAMPs）释放前炎症介质（如高迁移率族蛋白 B1 等）。 （4）基因水平：主要受核糖体蛋白 L8（ribosomalprotein L8，RPL8），铁反应元件结合蛋白（ironresponse element binding protein 2， IREB2），ATP 合成酶 F0 复合体亚基 C3（ATP synthase F0 complex subunit C3，ATP5G3），三四肽重复结构域 35（tetratricopeptide repeat domain 35，TTC35），柠檬酸合成酶（ citratesynthase， CS），酰基辅酶A 合成酶家族成员 2（acyl-CoAsynthetase family member 2，ACSF2）以及受代谢、储存基因 TFRC、ISCU、FTH1、FTL、SLC11A2 的调节。 铁死亡的实质是细胞内脂质氧化物代谢障碍，在铁离子催化作用下代谢发生异常，当细胞抗氧化能力减弱，脂质活性氧堆积，使细胞内氧化还原失衡，诱导细胞死亡。 二、铁死亡机制 抑制 GPX4 诱导铁死亡：GPX4 能降解小分子过氧化物和某些 脂质过氧化物，抑制脂质过氧化。研究发现，若细胞中 GPX4 表达下调则会对铁死亡更敏感；相反，若上调 GPX4 的表达，则会产生对铁死亡的耐受。因此，将 GPX4 抑制后将诱导细胞发生铁死亡。 抑制胱氨酸谷氨酸转运受体 (systemXC-)诱导铁死亡：通过systemXC-，谷氨酸与胱氨酸以1:1 比例交换，因此，谷氨酸的水平会影响到 systemXC- 的功能 。细胞外 高浓度的 谷氨酸 会抑制systemXC-从而诱导铁死亡。敲除 systemXC-的小鼠由于细胞外谷氨酸水平减少，可以防止神经毒性损伤。 p53 介导铁死亡：p53 是一种抑癌基因，通过下调 systemXC- 组分 SLC7A11 的表达抑制细胞对胱氨酸的摄取，导致谷胱甘肽过氧化物酶活性降低，削减细胞抗氧化能力，增强细胞对铁死亡的敏感性。同时，研究发现，在人肿瘤细胞中SLC7A11 过度表达，这种过表达能够抑制活性氧诱导的“铁死亡”，同时削弱 p53 3KR 介导的对肿瘤生长的抑制作用。 1、新陈代谢（1）细胞活性：CCK-8；铁死亡机制 1、新陈代谢 （1）细胞活性：CCK-8； 铁水平检测：细胞内可以使用 PGSK 探针，流式细胞术或共聚 焦显微镜检测细胞内铁含量的细胞膜透性染料，结果表明，在铁死亡的细胞中，PGSK 的绿色荧光会减弱；或者使用 Iron Assay Kit 检测细胞、组织中的铁水平； 活性氧水平：细胞内活性氧和脂质活性氧通过流式细胞术使用DCFH-DA（表达上调）或 C11-BODIPY 荧光探针检测（在铁死亡细胞中，探针会由红色转化为绿色）； qRT-PCR/WB 检测：检测与铁死亡相关的蛋白表达，如PTGS2、 NOX1、FTH1、COX2