elisa原理方法操作及注意事项.pptx

ELISA原理方法操作及注意事项会计学第1页/共58页1.　ELISA的原理 ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。第2页/共58页2.　ELISA的类型 ELISA法是免疫诊断中的一项技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，根据已经使用的结果，认为ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本,因此，也适合于血清流行病学调查。本法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。 第3页/共58页 根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体 条件，可设计出各种不同类型的检测方法用于临床检验的ELISA主要有以下几种类型：双抗体夹心法测抗原竞争法测抗原双抗原夹心法测抗体捕获包被法测抗体间接法法测抗体ABS-ELISA法竞争法测抗体第4页/共58页双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。 第5页/共58页双抗体夹心法测抗原第6页/共58页 间接法测抗体 间接法测抗体主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。第7页/共58页 间接法成功的关键在于抗原的纯度。虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果，但应尽可能予以纯化，以提高试验的特异性。特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质，例如以E.Coli为工程酶的重组抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能与受过E.Coli感染者血液中的抗E.Coli抗体发生反应。抗原中也不能含有与酶标抗人Ig反应的物质，例如来自人血浆或人体组织的抗原，如不将其中的Ig去除，试验中也发生假阳性反应。另外如抗原中含有无关蛋白也会因竟争吸附而影响包被效果。第8页/共58页 间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性IgG 。病人血清中受检的特异性IgG只占总IgG中的一小部分。IgG的吸附性很强，非特异IgG可直接吸附到固相载体上，有时也可吸附到包被抗原的表面。因此在间接法中，抗原包被后一般用无关蛋白质（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封闭固相上的空余间隙。另外，在检测过程中标本须先行稀释（1:40~1:200），以避免过高的阴性本底影响结果的判断。第9页/共58页间接法测抗体第10页/共58页 双抗原夹心法测抗体 双抗原夹心法与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗?HBs的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。 Title in here第11页/共58页双抗原夹心法测抗体 Title in here第12页/共58页 竞争法检测抗体 当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用竞争法检测特异性抗体。 Title in here第13页/共58页竞争法测抗体 Title in here第14页/共58页竞争法测抗体 Title in here第15页/共58页 竞争法测抗原 小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。小分子激素 、药物等ELISA测定多用此法。第16页/共58页竞争法测抗原 Title in here第17页/共58页 捕获包被法 在临床检验中测定抗体IgM时多采用捕获包被法。如用抗原包被的间接法直接测定 IgM抗体，因标本中一般同时存在较高浓度的IgG抗体，后者将竞争结合固相抗原而使一部份IgM抗体不能结合到固相上。 Title in here第18页/共58页捕获包被法测抗体 Title in here第19页/共58页ABS-ELISA法 ABS为亲和素(avidin)生物素(bi