细胞培养技术与实验安全知识粹讲.pptxVIP

细胞培养技术与实验安全知识粹讲主要学习内容一. 细胞培养的条件及环境二. 细胞培养前的实验准备三. 细胞原代和传代培养四. 体外培养细胞分型五. 细胞培养基本技术六. 常见细胞污染及其处理方法七. 实验安全一. 细胞培养的条件及环境条件：培养基（碳水化合物、无机盐、必需氨基酸、微量元素等）、血清（激素、生长因子等）、消化液（ 0.25％胰蛋白酶）、缓冲液（磷酸盐等）、抗生素（青霉素、链霉素等）环境：恒定温度（37℃）、CO2 （抑制NaHCO3?CO2反应，调节pH）、无菌（提供细胞生长的洁净环境）二. 细胞培养前的实验准备培养基（DMEM、1640、DMEM/F12、L-15等）配制和除菌（0.22um过滤）。血清、胰酶、抗生素的购买和分装。缓冲液的配制（PBS、Hanks等）和灭菌（高压或0.22um过滤）。培养器皿（枪头、滴管、培养皿、培养瓶、离心管、试剂瓶等）的灭菌（高压）。隔离服（高压灭菌-干燥-紫外）、移液器（75%酒精-紫外）。细胞培养用器皿的清洗和消毒? 一般玻璃器皿的清洗分为四个步骤：1、自来水浸泡2、洗涤剂刷洗(如有必要进行超声处理）3、泡酸（浓硫酸、重铬酸钾及蒸馏水）4、流水冲洗过夜，依次用蒸馏水、三蒸水漂洗，最后烘干备用 常用消毒方法：1、湿热灭菌法（高压蒸汽灭菌），121摄氏度，15～30min2、过滤除菌(如：血清的除菌）三. 细胞原代和传代培养原代培养取自体内新鲜组织或细胞并置于体外条件下生长，到第一次传代之前的阶段。特性：一般可持续培养1-4周。可见细胞分裂，但不旺盛，呈二倍体核型。与体内细胞性状相似性大，是检测药物很好的实验对象。三. 原代培养和传代传代培养细胞在体外环境中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中在进行培养的过程。特性：细胞增殖旺盛，在细胞全生命期中持续时间最长。30代内大部分可维持二倍体核型，为有限细胞系。传代30-50次左右，细胞增殖逐渐缓慢，甚至完全停止或衰退凋亡。可通过转化获得无限繁殖能力，成为无限细胞系。四. 体外培养细胞分型 （一）贴壁型：大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞，判断细胞形态时不能按照体内组织学标推判定，仅大致分成以下四型： 1.成纤维细胞型 2.上皮型细胞 3.游走细胞型 4.多型细胞型成纤维细胞 心肌细胞1. 成纤维细胞型胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。包括成纤维细胞，中胚层起源的心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮细胞，以及培养中细胞形态与成纤维类似者。 肾小管上皮细胞 乳腺上皮细胞2. 上皮型细胞细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。 3、游走细胞型： 呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。 4、多型细胞型： 有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。 游走细胞型 多型细胞型（神经细胞） 悬浮型细胞（二）悬浮型细胞见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞。胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易大量繁殖，可聚集形成细胞团。 细胞鉴定——STR基因分型分析多个STR基因座，可以准确判断交叉污染和细胞类型。高度灵敏，可以检测最低0.1ng DNA。人类细胞16个的基因座检测。小鼠细胞8个高度多态性位的基因组检测。人-鼠细胞交叉污染检测。细胞悬液（细胞数≥106个）或基因组DNA（ ≥ 20μL，浓度≥ 50ng/μL）。五. 细胞培养基本技术换液消化和传代冻存复苏1. 细胞换液贴壁细胞 直接换液：弃去旧培养液?PBS洗涤细胞?加入新培养液悬浮细胞 半定量换液：弃去1/3-1/2的旧培养液?加入新培养液2. 细胞消化和传代贴壁细胞 弃去旧培养液?PBS洗涤细胞? 加入胰酶消化，弃去胰酶?加入新培养液，吹打混匀?细胞悬液分瓶（皿），补充培养液悬浮细胞 全部细胞转移至15ml离心管，1000rpm离心5min?弃去旧培养液，PBS洗涤细胞?1000rpm离心5min，弃去PBS ?加入新培养液，吹打混匀?细胞悬液分瓶（皿），补充培养液3. 细胞冻存贴壁细胞 弃去旧培养液?PBS洗涤细胞? 加入胰酶消化，弃去胰酶?加入培养液终止消化，吹打混匀并行细胞计数?加入冻存培养液（含30%血清+10%DMSO），吹打混匀?转移至冻存管，缓慢降低温度至-196 ℃。悬浮细胞 全部细胞转移至15ml离心管，1000rpm离心5min?弃去旧培养液，PBS洗涤细胞?1000rpm离心5min，弃去PBS ?加入新培养液，吹打混