第四、五章噬菌体载体及粘粒及目的基因的准备、重组及重组子的鉴定.pptVIP

J基因到N基因—非必要区段占DNA总长度的1/3 当前1页，共37页，星期日。 当前2页，共37页，星期日。 当前3页，共37页，星期日。 三、?噬菌体的体外包装 *重组体DNA分子的转染(transfection)作用 105~106噬菌斑/?gDNA *体外包装 转导(transduction) 当前4页，共37页，星期日。 天然包装过程 当前5页，共37页，星期日。 体外包装过程 尾部突变-头 头部突变-尾 E-72%?E--累积尾部蛋白 D-与DNA进入头部及头部成熟有关?D--累积头部蛋白 当前6页，共37页，星期日。 四、凯伦噬菌体载体(charon) 两类 特点：酶切位点多、含LacZ、容量大 克隆程序:分离线性噬菌体DNA-酶切分离左右臂+中央区段-与外源DNA混合-包装 几kb~23kb 噬菌体载体及派生载体的优点：感染效率高 当前7页，共37页，星期日。 五、柯斯质粒载体 1、柯斯质粒载体的构建 定义：(cos site-carrying plasmid) eg.pHC79(?+pBR322) cos+与噬菌体包装有关的序列 ori+Ampr+Tetr 容量：31~45kb 当前8页，共37页，星期日。 当前9页，共37页，星期日。 2、柯斯质粒载体的特点 *具有?噬菌体的特性（环化） *具有质粒载体的特性 *高容量 3、柯斯克隆 优点：容量大、非重组体少 问题：分子内重组成多聚体（碱性磷酸酶处理） 基因间连接（电泳分级分离） 当前10页，共37页，星期日。 当前11页，共37页，星期日。 六、单链DNA噬菌体载体 *M13、f1、fd *优点：双链复制型、单双链均可转染宿主、颗粒大小受DNA多寡制约、易测出插入方向 *M13克隆体系 特性：LacZ、诱导及组成型的LacZ、成对构建（M13mp8、M13mp9） 当前12页，共37页，星期日。 当前13页，共37页，星期日。 七、噬菌体展示载体(phage display) 丝状噬菌体（M13/fd)表面-3~5拷贝geneIII产物-颗粒组装及F性须吸附 G.P.Smith-1985建立-在噬菌体表面表达蛋白 应用：噬菌体表面展示文库 *原理 *分离hGH变体 当前14页，共37页，星期日。 当前15页，共37页，星期日。 当前16页，共37页，星期日。 当前17页，共37页，星期日。 八、噬菌粒载体(phasmid) M13类的缺陷： -插入后遗传稳定性下降，且与片段大小有关 -实际上总以正向插入 -容量有限（1500bp） 改进的M13类-噬菌粒 -分子小：3kb -容量10kb -双向性（细菌质粒和phage） 当前18页，共37页，星期日。 当前19页，共37页，星期日。 T3+T7 当前20页，共37页，星期日。 1、?噬菌体载体的类型及其比较。 2、噬菌体的体外包装原理。 3、什么是凯伦噬菌体载体？有怎样的特点？ 4、什么是柯斯质粒载体？有怎样的特点？ 5、单链DNA噬菌体载体的优点。 6、噬菌体展示载体的工作原理。 7、噬菌粒载体的特点。 复习提纲 当前21页，共37页，星期日。 第五章 目的基因的准备、重组及重组子的鉴定 一、cDNA基因文库的构建（汇集生物体所有cDNA序列的重组DNA群体） 1、cDNA基因文库的优点： 病毒RNA 筛选简单 表达 测定基因结构（内含子 外显子）、时间调节基因表达特征分析 2、缺点： 无调节序列 低丰度mRNA克隆难 当前22页，共37页，星期日。 ClerkeCarbon公式：N=ln(1-p)/ln(1-f/g) 特异mRNA拷贝数/总mRNA种类 可克隆片段大小/基因组总长度 mRNA丰度 克隆基因的大小(载体容量) 10670/29%=87000 N=ln(1-99%)/ln(1-1/87000)=1.7x105 当前23页，共37页，星期日。 3、RNA的制备及纯化 总RNA的提取 mRNA的纯化-oligodT-纤维素柱层析 特异mRNA的富集（mRNA分级分离、 蔗糖密度梯度离心） 特异mRNA的分析鉴定 *mRNA体外翻译（麦胚、兔网织红细胞） *RNA电泳-Northern Blot 当前24页，共37页，星期日。 4、cDNA两链的合成 5、双链cDNA分子与载体的连接 *同聚物加尾 *linker-连接子 6、重组体导入宿主 转化、转染、电脉冲 当前25页，共37页，星期日。 RNaseH方法 当前26页，共37页，星期日。