谷胱甘肽转硫酶的制备及动力学研究.ppt

* * 谷胱甘肽转硫酶的制备及动力学研究 实验内容： （一）亲和层析法制备谷胱甘肽转硫酶 （二）测定酶活力、米氏常数和最大反应速度 （三）Folin-酚法测定蛋白质含量，计算比活力 * 谷胱甘肽转硫酶简介 谷胱甘肽转硫酶（Glutathion S-transferases，简称GSTs，）广泛存在于动物和人体的各种组织，哺乳动物肝脏中含量最高，约占肝可溶性蛋白的10%。GST是机体内一组具有重要解毒作用的同工酶家族，均为由两个亚基组成的二聚体，相对分子质量为45 000—49 000，各同工酶的等电点不同，多为碱性同工酶。 * 兔肝匀浆液及纯化样品SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱 * GST参与芳香环氧化物、过氧化物和卤化物的解毒作用，GST催化这些带有亲电中心的疏水化合物与还原型谷胱甘肽（GSH）的亲核基团GS－反应，中和它们的亲电部位，使产物水溶性增加，经过一系列代谢过程，最后产物为巯基尿酸，被排出体外，从而达到解毒目的。另外，GST还能共价或非共价地与非底物配基以及多种疏水化合物结合，具有结合蛋白的解毒功能。 * 亲和层析原理 有很多生物大分子与相应的分子间具有专一的可逆结合的特性，如酶与其底物、抑制剂、辅助因子，抗体与抗原，核酸与互补的碱基序列、核酸聚合酶、结合蛋白，激素与其受体、载体蛋白，细胞与其表面特异蛋白等等，它们依靠分子间的氢键、范德华力进行结合，这种专一的可逆结合力的称为亲和力。亲和层析的方法就是根据具有亲和力的生物分子间可逆地结合和解离的原理建立和发展起来的。 * 将一对能可逆结合和解离生物分子的一方作为配基，与具有大孔径、亲水性的固相载体相偶联，制成专一的亲和吸附剂，当被分离物随着流动相经过亲和吸附剂时，亲和吸附剂上的配基就有选择地吸附待分离物质，通过解吸附使待分离物质得以纯化。 亲和层析的优点：专一性结合，分辨率高，操作简单，通过一次性操作即可得到较高纯度的分离物质；具有浓缩作用，可以从含量很低的溶液中得到高浓度的样品；利用生物学的特异性进行分离，所以分离条件比较温和，能够很好地保持样品原有的生物学性质。 * 亲和层析法分离生物大分子示意图 配基 待分离的 生物分子 a. 载体 手臂 配基 亲和吸附剂 b. * d. 与待分离物质专一可逆结合的物质 c. 样品 杂质  * 亲和层析介质的制备 配基的选择：选择合适的配基是亲和层析中的重要环节，配基可以是有机小分子、生物大分子、染料等。根据待分离物质在溶液中与配基之间的亲和力的大小和专一性等特性进行选择，通过实验来确定理想的配基。例如选择酶的竞争性抑制剂、底物和辅助因子类配基可以纯化酶，选择互补的碱基序列、组蛋白、核酸聚合酶、核酸结合蛋白类配基可以纯化核酸等等。在亲和层析中，分离生物大分子的配基必须有适当的化学基团能与活化基团发生偶联作用，有较高的偶联率，偶联后配基和被分离生物大分子的专一结合特性不变，有效地分离目标产物；解吸附时不破坏生物大分子的生物活性和理化性质。 * 载体的选择：亲和层析的载体一般是凝胶类层析介质。一般比较理想的载体应具备稀松的多孔网状结构，对于溶液具有良好的亲水性、流动性和渗透性，大孔径凝胶介质可以有效地使凝胶内部的羟基得到活化，以保证较高的活化效率，提高了配基的有效浓度，提供较高的亲和容量；必须有足够数量的化学基团，经化学方法活化后，可以与大量的配基相偶联；具有良好的机械性能，保证亲和柱维持较好的流速；必须是不溶于水、化学惰性的，非特异性吸附作用弱；有良好的物理和化学的稳定性，在配基偶联、亲和层析、再生处理过程中不会因离子强度、温度、pH的变化，变性剂、去污剂的应用而破坏载体的物理化学结构，在介质的反复使用过程中能抗微生物和酶的侵蚀。 * 琼脂糖凝胶：目前应用最多的琼脂糖凝胶是瑞典Pharmacia公司生产的Sepharose，它具有理想载体的特性。它是由D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖交替结合而成的大分子多聚糖，靠糖链之间的次级键交联成的稳定网状结构的珠状凝胶，网状结构的疏密依靠改变琼脂糖浓度的方法来控制。如Sepharose 2B，4B和6B，其中阿拉伯数字表示凝胶中干胶的百分含量，机械强度随凝胶浓度降低而减弱。目前广泛使用Sepharose 4B来分离生物大分子， 本实验采用的是本院自己研制的Sepharose QT4，相当于Sepharose 4B。琼脂糖凝胶的多聚合链不是由共价键连接而成的，在使用中应当注意的问题有