基因工程的基本操作程序.ppt

PCR技术扩增与DNA复制的比较 PCR技术 DNA复制 相同点 原理 原料 条件 不同点 解旋方式 场所 酶 结果 碱基互补配对 四种脱氧核苷酸 模板、能量、酶 DNA在高温下变性解旋 解旋酶催化 体外复制 细胞核内 热稳定DNA聚合酶 细胞内的DNA聚合酶 大量的DNA片段 形成整个DNA分子 第二十五页，共六十一页。 （三）、人工合成法： 基因较小，核苷酸序列已知，可以利用DNA合成仪人工合成 第二十六页，共六十一页。 反转录法 目的基因的信使RNA 目的基因 化学合成法 肽链氨基酸序列 信使RNA序列 基因的核苷酸序列 目的基因 合成 逆转录 人工合成法 推测 推测 单链DNA 合成 第二十七页，共六十一页。 1、下列属于获取目的基因的方法的是( ) ①利用mRNA反转录形成②从基因组文库中提取 ③从受体细胞中提取 ④利用PCR技术 ⑤利用DNA转录 ⑥人工合成 A.①②③⑤ B.①②⑤⑥ C.①②③④ D.①②④⑥ 2、有关基因工程的叙述正确的是 （ ） A、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体 D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料 D 第二十八页，共六十一页。 1.作用： 二. 基因表达载体的构建——核心 IMN 2.组成： ①使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代。 ②同时使目的基因能表达和发挥作用。 (3)终止子： (4)标记基因： (2)启动子： (1)目的基因。 （5）复制原点： 不同受体细胞，目的基因导入受体细胞的方法不同，基因表达载体的构建有所差异。 是RNA聚合酶识别和结合部位。 是使转录在需要的地方停止。 是鉴别受体细胞中是否含有目的基因 从而将含有目的基因的细胞筛选出来。 是复制的起点。 第二十九页，共六十一页。 ①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构 ②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键 ③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少 ④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。 注意 第三十页，共六十一页。 寻根问底：将目的基因直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？ 提示：有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体植物。此法目前争议颇多，严格来讲不算基因工程。 第三十一页，共六十一页。 思考与探究：1.作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？ 不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是： （1） 生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达； （2） 通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录； （3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记； （4） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等； （5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。 第三十二页，共六十一页。 3、将目的基因导入受体细胞 转化 —— 方法 将目的基因导入 植物细胞 将目的基因导入 动物细胞 将目的基因导入 微生物细胞 农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法 ——显微注射法 ——感受态细胞法 目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程 受体细胞 稳定 表达 常用的受体细胞： 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。 第三十三页，共六十一页。 1、将目的基因导入植物细胞的方法： （1）农杆菌转化法 ①农杆菌特点： 易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力 ②原理：Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。 双子叶植物、祼子植物 适用生物? 第三十四页，共六十一页。 目的基因 Ti质粒上的 T－DNA 插入 植物细胞 农杆菌 染色体DNA上 维持稳定和表达 并整合到 导入 感染 同时 T-DNA 导入 ③过程： 第三十五