动物免疫学实验技术-酸性α-醋酸萘酯酶染色技术.doc

PAGE · PAGE 1 · 第二十章 酸性α-醋酸萘酯酶染色技术 （Acid α-naphthyl acetate esterase stain technique） 一、原理 T淋巴细胞质内含有酯酶，可以水解α-醋酸萘酯，产生α-萘酚，α-萘酚又可与重氮付品红偶联生成不溶性的偶氮付品红萘酚，在T淋巴细胞浆酯酶存在的部位生成不溶性的黑红色的颗粒沉淀，而B淋巴细胞无此反应。以资鉴别。 二、材料与试剂 1．固定液 40%甲醛 2．分层液（聚蔗糖－泛影葡胺） 比重1.077+0.001，配制见细胞分离技术一章。 3．染色液 （1）付品红液：取2g付品红加入2N HCl 100ml, 温水浴溶解后保存于4℃备用。 （2）亚硝酸钠溶液（现用现配）：取0.14g亚硝酸钠加入双蒸馏水10 ml，振荡溶解。 （3）α-醋酸萘酯溶液：取2gα-醋酸萘酯溶于乙二醇单甲醚100ml中，贮于棕色瓶内，于4℃保存。 （4）0.067 Mol/L pH7.6PB液 甲液 KH2PO4 9.08溶于1 000ml双蒸馏水 乙液 Na2HPO4 9.47g溶于1 000ml双蒸馏水 （6）甲基绿复染液：取1g甲基绿，溶于100ml双馏水中，4℃保存。 （7）应用染色液（孵育液）的配制 取1ml亚硝酸钠溶液缓慢滴入1ml的付品红液中，边加边摇匀，付品红液由红色变为浅黄色，混合后，静置1min～2min，将此混合液倒入30ml pH7.6PB液中，充分混合后，再加入α-醋酸萘酯溶液0.85ml，边加边搅拌，混匀后使用。 三、操作方法 1．标本的制备 取肝素抗凝血1ml，加等量或适量的生理盐水稀释，取分层液2ml加入离心管内，然后将上述稀释的血液沿管壁缓缓加入至分层液上，注意不要打破两层界面。以水平转子离心机1 000～1 500r/min离心20min。结果形成四层，最上面第一层为血浆层，第二层为淋巴细胞（包括单核细胞）层，第三层为分层液，第四层为红血球。用毛细管吸取血浆层，然后吸取淋巴细胞放入适量的Hank’s液（或生理盐水）中，充分摇匀。2 000r/min离心5min～10min弃上清液，再重复洗涤一次，即获淋巴细胞。以此淋巴细胞粥涂片。自然干燥后，以40%甲醛蒸汽固定10min。 2．染色镜检 （1）于固定的标本片上滴加孵育液，以覆盖为度，37℃染45min～60min，蒸馏水冲洗。 （2）甲基氯复染1min～5min，蒸馏水冲洗。 （3）自然干燥，镜检。 四、结果判定 在胞浆内出现大小不一、数量不等的黑红色颗粒的细胞为T淋巴细胞，无此颗粒的为B淋巴细胞。同时计数淋巴细胞100～200个。求出它们各占的百分比。 几种动物的T淋巴细胞正常值 马 57.8+2.009% 骡 51.8+2.037% 小白鼠 76.42+4.44% 豚鼠 73.43+8.04% 兔 77.0+2.79% 人 62.3+8.62% 五、注意事项 1．本试验对染色剂的pH值要求比较严格否则不易染上。染色时间在各动物也不一致，见表19-1。 表19-1人与几种动物酯酶染色的最适pH值与染色时间 动物 最适pH 最适染色时间 人 猫 狗 兔 豚鼠 大鼠 小白鼠 猪 绵羊 山羊 马 驴 6.5 5.5 6.0 5.5 6.0 6.5 6.5 7.0 6.0 6.5 6.1 6.0 1 6 1 6 5 1 1 4 1 1 2 1.5 有人主张孵育液的pH值必须在.5.8～6.4 2．固定液可用2.5%戊二醛代替甲醛，据认为其效果更好，标本清晰，颗粒鲜明。固定方法为4℃固定10min，然后用蒸馏水冲洗，自然干燥。制片后迅速固定，以免细胞死亡破裂，酶外溢，造成假阴性。 3．所用试剂必须要纯品，最好是A．R．级。所有器皿必须洗净，用蒸馏水冲洗，且专用。 4．有人认为用碱性品红可代替品红，丙酮可代替乙二醇单甲醚，孔雀绿可代替甲基绿。 5．酯酶染色法与E-玫瑰花环的关系：有人认为，酯酶染色法可以代替E-玫瑰花环试验，至少两者应相应一致。