动物免疫学实验技术-玫瑰花环技术.doc

PAGE · PAGE 1 · 第十九章 玫瑰花环试验技术 （Rosette formation test technique） 一、E玫瑰花环试验 基本原理 玫瑰花环试验是体外检测人和动物细胞免疫功能的一种方法。E—玫瑰花环试验是T淋巴细胞计数的一种重要方法。由于人和动物的T淋巴细胞表面有红细胞受体，因此红细胞可以粘附到T淋巴细胞的周围而形成玫瑰花样的细胞团。在红细胞中，以绵羊红细胞最为常用。B淋巴细胞则没有红细胞受体，所以不能形成E—玫瑰花环，以资鉴别。 （二）材料与试剂 1．肝素抗凝剂 2．淋巴细胞分层液 配制方法见细胞分离技术。 3．无Ca2+、Mg2+ Hank’s液 NaCl 4.00g NaHCO3 0.175g KCl 0.20g Na2HPO4.12H2O 0.076g KH2PO4 0.030g 葡萄糖 0.50g H2O加至 500.00ml 用5.6％NaHCO3调pH至7.2，115℃15min灭菌。4℃贮藏备用。 4．5.6％NaHCO3液 NaHCO3 5.60g H2O 100.00ml 115℃20min灭菌, 4℃贮藏备用。 5．0.8％戊二醛溶液 25％戊二醛溶液 0.32ml Hank’s液 9.68ml 用前配制。 6．Giemsa—weight染色液 Giemsa粉 0.03g Weight粉 0.30g 甲醇 100.00ml 先将染料一起放入研钵内，加入少量甲醇，研磨细，然后倒入瓶内，并用甲醇冲洗研钵内染料，一起倒入玻瓶内，补足甲醇量，备用。 （三）操作方法 1．取肝素抗凝血2ml，置37℃水浴自然沉淀30min～40min，吸取全部血浆（约1ml）。 2．于血浆中加Hank’s液数毫升，洗涤，1 500r/min离心5min～10min，弃上清。重复洗涤4次，沉淀均匀即为淋巴细胞悬液。 3．采绵羊肝素抗凝血，加数倍Hank’s液，洗涤3次，最后以Hank’s配成10％悬液，4℃保存。 4．取0.1ml淋巴细胞悬液，加10％红血球悬液0.1ml，加小牛血清0.1ml。 5．37℃水浴10min，低速离心（600r/min）5min。 6．吸弃多余的上清液后，放入4℃冰箱2h～4h。 7．取出后，将沉淀轻轻摇起，加0.8％戊二醛0.1ml，混匀后4℃固定15min。 8．将干净的玻片用Hank’s液沾湿，滴一小滴混悬液，让其自然散开即可。 9．自然干燥后，用姬姆萨—瑞氏液（Giomsa—weight）或苏木精—伊红染色，水洗，干燥镜检。 （四）结果判定 凡一个淋巴细胞结合3个或3个以上的红细胞者为一个E—玫瑰环。检查200个淋巴细胞，按下列公式计算其玫瑰花环形成率。 附：某些动物的E—玫瑰花环率 马： 38.00±2.00％（29.01％～51.35％） （Tarr,M.J.） 31.20±9.64％（18.70％～51.29％） （成都军区军马防治检验所） 34.80±4.16％（豚鼠RBC） （哈兽研） 30.70±4.30％（绵羊RBC） （哈兽研） 36.53±12.09％（豚鼠RBC） （东北农业大学） 骡： 27.50±5.46％（14％～38％） （成都军区军马防治检验所） 驴： 32.90±3.60％ （哈兽研） 42.90±3.78％ （哈兽研） 牛： 37.70±4.20％ （Binns） 45.30±4.00％ （James） 绵羊：30.70±2.00％ （Binns） 山羊：13.30±1.20％