中和试验检测方法.ppt

实验六 血清中和试验 二、原理 抗体与相应的病毒粒子特异性地结合，使后者丧失感染能力。 三、用途 1、疾病诊断 2、病毒分离株的鉴定 3、不同病毒株的抗原关系研究 4、疫苗免疫原性的评价 5、免疫血清的质量评价 6、测定实验动物血清中是否存在抗体 四、材料 1、长满单层的细胞1瓶 2、胰酶、吸球、吸管、生长液 3、96孔细胞培养板 4、加样器、枪头 5、病毒液（PRV） 6、待检血清、阴性对照血清 五、方法 1、固定病毒—稀释血清法 将不同稀释度的血清与固定量的病毒液（一般为100或200个TCID50、EID50或LD50）混合感作一定时间以后，接种于敏感细胞、鸡胚或实验动物，测定被检血清阻止组织培养细胞、鸡胚或实验动物发生病毒感染的能力及其效价。 以能保护50%组织培养细胞、鸡胚或实验动物不发生病变、感染或死亡的血清最高稀释倍数，作为该血清的50%中和效价（PD50） 操作步骤： 血清稀 CPE 无CPE 累计 保护率% 释度 孔数 孔数 CPE孔数 无CPE孔数 1:2（10-0.3） 0 4 0 15 100(15/15) 1:4（10-0.6） 0 4 0 11 100(11/11) 1:8（10-0.9） 1 3 1 7 87.5(7/8) 1:16（10-1.2） 1 3 2 4 66.7(4/6) 1:32（10-1.5） 3 1 5 1 16.7(1/6) 1:64（10-1.8） 4 0 9 0 0(0/9) 1:128（10-2.1） 4 0 13 0 0(0/13) 距离比例=（高于50%的保护率-50% ）/ （高于50%的保护率—低于50%的保护率） ? =（66.7-50）/（66.7-16.7） = 0.33 lgPD50=高于50%的保护率血清稀释度的对数+距离比例×稀释度对数的差 =-1.2+0.33×(-0.3) =-1.299 PD50=-1.299的反对数=0.05=1/20 即1:20稀释的待检血清可保护50%的组织培养细胞免于出现CPE 2、固定血清——稀释病毒法 在固定量的血清中，加入等量不同稀释度的病毒，用对照非免疫血清（对照组）和待检血清同时进行测定，计算每一组的TCID50、EID50或LD50，然后计算中和指数。 操作步骤： * * 一、实验目的 了解中和试验的基本原理和几种不同的测定方法，掌握固定病毒—稀释血清法的操作步骤和计算方法及含义。 测定病毒液的TCID50 将测好TCID50的病毒液稀释成200个TCID50的病毒悬液。 在96孔微量培养板中将血清（预先56℃灭活30min）作连续倍比稀释（具体方法是在96孔板中先加入50μl生长液，再加50μl待检血清，混匀后，吸50μl至下一孔，如此下去。一直到1:256），每个稀释度作4孔。 在上述各孔内加入50μl稀释好的病毒液，混匀后放入37℃ 5%CO2培养箱中作用45min-60min。 同时设待检血清毒性对照，阴、阳性血清对照，病毒对照和正常细胞对照，其中病毒对照要作 200个TCID50、20个TCID50、2个TCID50、0.2个TCID50 4个不同浓度的对照。 感作完成后每孔加入100μl细胞悬液，放37℃ 5%CO2培养箱培养，逐日观察并记录结果，一般要观察5-7天。 结果计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法进行。 将病毒作连续10倍稀释 将稀释好的病毒接种96孔板，每个稀释度接种一纵排共8孔，每孔50μl