waters e2695高效液相色谱.ppt

. 主讲人：马贵红 日期：2010-07-17 高效液相色谱仪操作方法 Waters e2695 型 什么是高效液相色谱法 High Performance Liquid Chromatography 高效液相色谱法，简称：HPLC 是一种基于仪器方法的高效能分离手段： 高性能的色谱柱，高精度、耐高压的输液泵以及高灵敏度的检测器…… 广泛应用于各个领域： 医药 / 环保 / 石化 / 生命科学 / 食品及农业…… 在技术，理论及应用上仍处于发展阶段 定量分析主要基于与标准品的比较 是其最大应用领域 定性分析；不是色谱的强项 基于样品的保留时间比较 借助于和其联用的紫外、质谱或其他检测器 对定量及定性分析的要求 灵敏度、精度及准确度的要求 样品量的要求；复杂样品的分析能力 容易使用 什么是高效液相色谱法 高效液相色谱如何工作 一个储液瓶装有溶剂[称为流动相，因为溶剂是流动的]。 一个高压泵[溶剂传输系统或称溶剂管理器]用来产生和计量流动相的流速，一般是毫升/分钟。 一个进样器[样品管理器或自动进样器]可以将样品导入[注射]连续的流动相 ，并由流动相携带样品进入高效液相色谱柱。 色谱柱装有能获得分离效果的填料。这种填料称为固定相因为它被柱硬件包围住。 检测器用来查看化合物流出色谱柱时被分开的谱带[大多数化合物没有颜色，所以人眼观察不到]。 流动相流出检测器可被送至废液瓶，或按需被收集。 当流动相含有一个分开的化合物谱带，高效液相色谱可以收集含有纯化的化合物的该洗脱组分，用于进一步分析。 注意高压管路和附件用来连接泵、进样器、色谱柱和检测器单元，形成流动相、样品和化合物分离谱带的通路。 检测器连接计算机数据站，高效液相色谱系统单元先记录电信号，再将电信号转换为色谱图，在显示屏上展现出来。 定性和定量样品内溶物浓度。 由于样品中化合物性质差异很大，几种类型的检测器被开发出来。 如果一个化合物能吸收紫外光，可使用紫外吸收检测器。 如果这个化合物发荧光，可使用荧光检测器。 如果该化合物没有上述性质之一，可使用更广泛的检测器，如蒸发光散射检测器[ELSD]。 最强大的方式是顺序使用多个检测器。例如，紫外和/或蒸发光检测器可和质谱仪[MS]联用来分析色谱分离的组分。这样，从一次进样，可得到分析物的更多综合的信息。将质谱与高效液相色谱系统耦合称之为液质联用. 高效液相色谱如何工作 液相色谱的基本流程图 流动相 泵 色谱柱 检测器 泵输液 分离 检测 记录 A E G B C D F 进样阀 进样 液相色谱的各部分示意图 液相色谱实验所需的基本参数--亦称色谱条件 流动相：种类及配比，等度或梯度 固定相：色谱柱类型及内径、长短 流动相输送系统参数：流速 检测器参数：紫外检测波长，灵敏度等 温度控制 进样量 仪器组成及开机 溶剂管理系统的准备 样品管理系统的准备 运行样品 数据采集 报告打印 关机 Waters e2695 型高效液相色谱仪操作方法 Waters e2695 型高效液相色谱仪操作方法 仪器组成及开机 1 仪器组成 Waters e2695 分离单元 2498型紫外检测器 色谱管理工作站 打印机  四元梯度洗脱的溶剂输送系统 四通道在线真空脱气机 可容纳 120 个样品瓶的自动进样系统 柱温箱 内置的柱塞杆密封垫清洗系统 溶剂瓶托盘 液晶显示器 键盘用户界面及软盘驱动器 2 开机 打开电源至on位置，开机依次接通 2695 分离单元、检测器、计算机和打印机的电源。接通后，约 20s 仪器开始自检，约 1min 后，显示主屏幕，此时继续各部件的初始化。 溶剂管理系统的准备 流动相脱气确认所有溶剂管路都充满溶剂，按【 Menu/Status 】，进入“ Status （ 1 ）”屏幕 溶剂管理系统的准备 必须用色谱纯有机溶剂，水或缓冲盐要用超纯水； 水相流动相需要每48h重新配制，特别是100%含水流动相； 检查6根管子是否均在液面下，必须保证6根管子全部插到溶剂瓶底部。 打开真空脱气机（degasser） Wet prime（执行湿灌注） 流动相平衡色谱柱 同理温度、流速都可在此控制面板设定！ 流动相特性 （1）液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况； （2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。 （3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。 常用溶剂的极性顺序： 水(最大) 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异