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PCR技术问题释疑 “PCR技术”是高中生物学选择性必修三中的教学内容，是DNA分子体外扩增的的重要应用。教材只对这部分知识进行简单的介绍。但由于这部分知识的微观性和抽象性，在教学过程中学生对PCR技术过程中的一些问题感到难以理解，并由此提出了许多问题。现将这些问题归纳、分析如下。 1．?常规PCR的流程是怎样的？ PCR技术全称聚合酶链式反应，是一种分子生物学技术，现已被广泛运用于临床和实验室，用于扩增特定的DNA片段。其基本原理就是在体外模拟细胞内DNA复制的相关条件，最终完成特定基因的体外复制。PCR技术由变性、退火、延伸三个基本步骤完成。 1.1变性 变性的目的是使模板DNA双链解旋成为单链以便与引物结合，通常加温至95℃（这是Taq酶进行30个左右循环而活力不致受到过多损失时能耐受的最高温度）。模板的完全变性对PCR成功与否至关重要，第一轮循环中变性时间往往为10min，然而根据经验，在其他各次的循环中一般95℃ 30s足以使各种模板完全变性。可能的情况下可缩短该步骤时间，因为变性时间过长会损害酶活性。当模板的G+C含量超过55%时，需要更高的变性温度，可选用来源于古细菌的DNA聚合酶，因为它比Taq酶更能耐受高温。 1.2退火（复性） 模板变性成单链后，温度快速降至退火温度，引物与模板DNA单链的互补序列可发生结合。退火温度的选择至关重要，如果退火温度太高，引物不能与模板很好地结合，扩增效率将会非常低；如果退火温度太低，引物将产生非特异性结合，从而导致非特异性DNA片段的扩增。退火时间一般为30-60s，足以使引物与模板之间完全结合。 1.3延伸 模板-引物结合物在Taq酶的作用下，沿着5’→3’的方向合成一条与模板DNA链互补的链。延伸时的温度常为72℃（Taq酶的最适温度为72℃-78℃）。在最适温度下，Taq酶的聚合速率约为2000bp/min。但作为一个由经验确定的规则是，靶基因的每1000bp的扩增产物的延伸时间被设计为1min。另外，延伸时间随扩增片段长短而定，甚至在所扩增目的基因的长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略。 重复循环“变性→退火→延伸”过程就可获得更多的半保留复制链，而且这种新链又可成为下次循环的模板。大多数PCR含25-40循环，过多易产生非特异扩增。在最后一个循环后，反应在72℃维持5-10min，使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。 2． 在PCR技术操作中，是否需要能量，需向溶液中加ATP吗？ DNA分子在PCR仪中扩增与在细胞内复制相似，也需要原料、能量、酶、引物、适宜的温度和pH等，但PCR技术操作中不需要单独提供ATP作为供能物质。在PCR技术中，DNA复制的解旋断裂氢键的能量来自PCR仪的加热，高温达90℃~95℃时DNA分子双链即打开，dNTP的连接能量来源于Taq酶聚合基本单位dNTP加入到延伸链的3端与上一个核苷酸形成磷酸二酯键时释放一个焦磷酸PPi，焦磷酸不稳定极易水解，释放能量并产生磷酸，这两个反应互相偶联，推动Taq酶聚合单体延伸DNA分子。 3． PCR技术中加入的“引物”是什么？有什么作用？引物会在PCR仪中复制吗？ 引物是在DNA分子复制时起引导作用一段短RNA或单链DNA片段，可结合在脱氧核苷酸链上与之互补配对的区域，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，DNA聚合酶可由其3’端开始合成新的核酸链。细胞内的引物是RNA链，由RNA酶根据DNA链碱基序列自动合成。 在PCR技术中，引物是人工合成的两段寡核苷酸链序列，是单链DNA片段。由于DNA聚合酶的特异性和DNA分子两条链的两端的差异性，决定了DNA分子体外扩增时必需设计两种引物，分别与DNA分子两条模板链的两端的感兴趣区域互补，以利于DNA聚合酶由此定向向前延伸，起到很好的引导作用。对于一段需扩增的DNA的核苷酸序列，引物可根据这一序列经计算机设计并合成，使其能有效地扩增模板DNA序列，引物设计的优劣直接关系到PCR技术扩增DNA的成功与否。引物不会在PCR仪中复制，引物是设计并配比好后加入PCR仪溶液中的。体外人工设计的引物广泛用于DNA聚合酶链反应（PCR技术）、测序和探针合成等。 4． PCR引物的设计有遵循什么原则？ 尽管有很多因素可影响PCR扩增反应的效率与特异性，但最关键的因素要数引物的设计。引物设计的首要目标是其特异性，只有当每条引物都能特异性地与模板DNA中的靶序列退火形成稳定的结构时才能达到这个目的。 引物设计主要遵循如下原则： ①引物的长度一般在18~25bp，太短则特异性不够强；太长则退火温度会比较高。 ②引物G+C含量以40%-60%为宜，太少扩增效果不佳；过多则易出现非特异条带。4种碱基最好随机分布。 ③两条引物之间不能有连续4个碱基的互补配对，否则加入的引物自身形成双链