(整理)实时荧光定量PCR的原理及实验.docx

实时荧光定量 PCR 的原理及实验 无论是对遗传病 (如地中海贫血和血友病) 、传染病 (如肝炎和艾滋病) 或肿瘤 进行基因诊断，还是研究药物对基因表达水平的影响，或者监控药物和疗法的治 疗效 果，定量 per 技术都可以发挥很大作用。定量 per 技术的必威体育精装版进展是实时荧 光定量。该 技术借助于荧光信号来检测 per 产物，一方面提高了灵敏度，另一方 面还可以做到 per 每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定 et 值，从而根据 et 值确定 起始 dna 拷贝数，做到了真正意义上的 dna 定量。这 是 dna 定量技术的一次飞跃。 根据最终得到的数据不同，定量 per 可以分为相对定量和绝对定量两种。 典 型的 相对定量如比较经过不同方式处理的两个样本中基因表达水平的高低变化， 得到的结果 是百分比；绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中基因的拷贝数或 浓度。根据所使用 的技术不同，荧光定量 per 又可以分为 taqman 探针和sybr green i 荧光染料两种方法。 比较而言， 探针杂交技术在原理上更为严格，所得 数据更为精确；荧光染料技术则成本 更为低廉，实验设计更为简便。在选择实验 方案时要根据实验目的和对数据精度的要求 来决定。 定量实验与定性实验最大的不同，是要考虑统计学要求并对数据进行严格的 校正， 以消除偶然误差。因此重复实验和设立内对照非常重要。由于各种各样的 客观原因，这 一点在实践中往往被轻视或忽视，需要着重强调。当然，与定性实 验一样，定量 per 也 要设立阴性和阳性对照，以监控试剂和实验操作方面可能出 现的问题。 1 为什么终点定量不准确？ 我们都知道理论上 per 是一个指数增长的过程，但是实际的 per 扩增曲线并 不是标 准的指数曲线，而是 s 形曲线。这是因为随着 per 循环的增多，扩增规模 迅速增大， taq 酶、 dntp、引物，甚至 dna 模板等各种 per 要素逐渐不敷需求， per 的效率越来越低， 产物增长的速度就逐渐减缓。当所有的 taq 酶都被饱和以 后， per 就进入了平台期。由于各种环境因素的复杂相互作用，不同的 per 反应 体系进 入平台期的时机和平台期的高低都有很大变化， 难以精确控制。所以，即 使是重复实验，各种条件基本一致，最后得到的 dna 拷贝数也是完全不一样的， 波动很大(图 1 )。 图 1 同一个样本重复 96 次 per 的扩增曲线 传统的定量方法，如溴乙锭染色或放射性核素掺入标记后的光密度扫描等， 测定的 都是 per 的终产物，而不是起始 dna 拷贝数。由于 per 的终产物量与起始 模板量之间没 有线性关系，所以根据最终的 per 产物量不能计算出起始 dna 拷贝 数。 对于绝大多数实验，比如甲肝的诊断、药物疗效的监测等，需要测定的都是 per 放 大之前标本中的 dna 原始拷贝数，经过 per 扩增以后的 dna 拷贝数已经不 能反映真实情 况。在这种情况下，就不能采用终点定量，而要根据 et 值确定 dna 起始拷贝的数量。 2 为什么 et 值与起始模板拷贝数成线性关系？ et 值的定义是 per 扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐 点所对 应的循环次数。从图 1 的重复实验中可以直观地看到，尽管平台期 dna 拷贝数波动很 大， et 值却是相对固定的。如果用不同浓度的 dna 作 per，可以看 出 dna 浓度越高， et 值越小。 dna 浓度每增加 1 倍， et 值减小 1 个循环。 et 值 与模板 dna 的起始拷贝数成反 比。 这一结论可以从数学上严格证明。 为使表达式简便，以下推导忽略 per 效率 等细节。如果考虑这些因素，可以在方程上增加修正项。这些修正项的增加并不 改变方 程的线性性质。 一般地，我们有 rn=rb+xo(1+ex)nrs,也就是说第 n 次 per 循环时的荧光信 号强度 (rn)等于背景信号强度(rb)加上每个分子的荧光强度( 即单位荧光强度， rs) 与分子数目的 乘积。当循环次数 n = et 时，则有 rt=rb+xo(1+ex)etrs 。两边取 对数，得 log(rt -rb) = logxO + etlog(1+ ex) + logrs 。整理此式， etlog(1+ ex)= -logxO + log(rt -rb) -ogrs。 G 匸 log 丘占 | _只外- log % 『二仏 1 +叭) 硕十石 所以对于每一个特定的 per 反应来说， ex、rt、rb 和 rs 都是常数，所以 et 值与 log x0 成反比，也