分子生物学实验课件：6重组克隆子的鉴定.ppt

一、正确的引物设计 引物长度和GC%含量 15-60 bp，40%-60% Tm值： Tm=4℃(G+C)+2℃(A+T ) Ta=Tm - 5℃ 引物的端部 3’端起始碱基决定特异性，错配延伸效率 TG=CA 5’端碱基可呈游离状态，可被修饰（如加酶切位点，引入突变位点，插入启动子序列等） 4. 引物无回文对称结构（发夹结构） 5. 引物自身不能配对 5’----AGCT3’ 3’TCGA----5’ 引物二聚体（反应底物，与靶序列竞争酶和dNTP） 6. 二引物间不能配对 7. 二引物的Tm值相近 PCR反应的忠实性 Taq酶没有3’-5’的外切活性而不能自行校正，从而导致错掺 测序、定点诱变和克隆 减少错掺的对策： 加入Taq酶后迅速反应，避免低温下进行的链延伸；酶浓度不可过大；dNTP 不可过浓；Mg2+浓度适中 6.1.8 容易污染 防治方法： 短波紫外线照射30分钟； 器皿类可用稀酸碱泡，使碱基脱嘌呤；PCR管、枪头等一次性使用； 试剂湿热灭菌后小管分装； 加模板DNA后盖紧盖子，打开盖子前离心甩下小液滴，再慢慢打开，防止开盖过快，形成气溶胶。 每次反应都应设立阳性，阴性对照。 * 实 验 六 重组克隆子的鉴定（菌落PCR技术） 从本节课起，开始考察同学们的实验操作 1. 无菌操作：酒精灯的合理使用，保持枪头盒，EP管盒的无菌，各种溶液不被污染。 2. 独立完成实验：不要随意走动串门，不要相互加各种溶液，不要让其他同学帮自己该做的实验。 3. 及时做好标记：标记规范合理，不要搞错样品和材料。 4. 及时改正错误：对于某些操作的错误，及时改正。 5. 合理规范使用实验器材：包括移液器，各种仪器等。 实验管(1#,2#,3#) 阴性对照管(-) ddH2O 17.5μL 17.5μL 10xbuffer 2.5 μL 2.5 μL 2.0mMdNTPs 2.0 μL 2.0 μL Primer1 1.0 μL 1.0 μL Primer 2 1.0 μL 1.0 μL Template DNA (细枪头粘菌) — Taq 1.0 μL 1.0 μL 反应总体积 25 μL 25 μL 在0.2ml Ep管(标记)中建立25×4=100μl 反应体系，再分装到PCR小管中，最后加不同的模板DNA（菌），混匀。 细枪头粘菌：镊子取细枪头,枪头粘1个菌落,然后置入EP管,用手转动枪头几圈,弃枪头。(在平板上做好标记) 循环扩增：按下述程序进行扩增 95℃ 预变性 5 min 94 ℃ 变性 45 sec 50 ℃ 退火 45 sec 72 ℃ 延伸 45 sec 72 ℃ 延伸 5 min 30 cycles 背景理论知识 Section 1 重组子鉴定可从以下水平进行： DNA水平： 快速抽提酶切分析 原位杂交 Southern杂交 DNA顺序分析 PCR检测 mRNA水平： RNA杂交 反转录-PCR 蛋白质水平：免疫沉淀检测法 功能水平： 抗性反应 显色反应 PCR技术的发明 PCR的发明是DNA操作技术的革命 美国Mullis教授 开汽车时的联想 逶迤崎岖的山路——DNA双螺旋 行驶的汽车——一小段DNA引物