分子生物学实验课件：2质粒DNA的酶切鉴定及电泳检测.ppt

* 实 验 二 质粒DNA的酶切鉴定及电泳检测 添加顺序 无菌ddH2O 4 μl 1 10xbuffer O 1 μl 2 质粒DNA 3 μl 3 BamHI 1 μl 4 NotI 1 μl 5 ———————————————— 总体积 10 ul 混匀后,点动（Short）离心， 37℃酶切60分钟。 小量酶切体系 背景理论知识 Section 1 掌握质粒DNA限制性酶切分析的方法和技术； 学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度和纯度的原理； 了解电泳过程中各因素对测定结果的影响； 掌握制胶、电泳、浓度测定的基本分析技术。 2.1.1 实 验 目 的 类型 I型 II型 III型 特异地结合于一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列之内或其附近的特异位点上，并在此切割双链DNA。 多数限制性内切酶识别长度为4-6个核苷酸，呈二元对称，少数识别更长的序列， 有的切割后形成平端，有的形成粘端。 2.1.2 限制性内切酶 Sticky end or cohesive end Hind III BamHI EcoRI Not I A|AGCT T G|GATC C G|AATTC GC|GGCC GC T TCGA|A C CTAG|G CTTAA|G CG CCGG|CG Blunt end EcoRV GAT | ATC CTA | TAG cutting sites are marked by | 2.1.2 限制性内切酶 已经发现和鉴定了200多种 EcoRI特异识别GAATTC及其互补碱基组成的双链片段 粘性末端 T4连接酶 2.1.2 限制性内切酶 2.1.2 限制性内切酶 BamHI NotI pET28a 5.37kb BamHI（661） NotI（1398） pEGFP-N3 4.7kb EGFP(720bp) 40bp 5.3kb Plasmid Digested Marker 738bp 3962bp 酶单位定义：在指明pH与37℃，在0.05mL反应混合物中，1小时消化1μg的λDNA的酶量为1单位。 酶反应条件：缓冲体系（多酶切原则） 酶切温度 反应时间 DNA的纯度和浓度。 加样顺序：水+缓冲液+DNA+酶。 2.1.2 限制性内切酶 2.1.2 限制性内切酶 影响限制性内切酶的因素： DNA制品中的污染（蛋白质、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS) 解决办法： 增加酶反应体积以稀释可能的抑制剂 增加酶作用单位(过多的甘油抑制酶活性) 延长反应时间 （1-16小时） 部分酶切和完全酶切 （克隆常用手段） 酶的保存 -20℃ 2.1.2 限制性内切酶 酶的星号活性*: 改变酶切条件时酶的识别位点专一性下降的现象。 限制性内切酶识别特异性放宽。 EcoRⅠ在正常情况下识别GAATTC序列发生切割，但如果缓冲液中甘油浓度超过5%，其识别位点发生松动，可在AATT处发生切割，EcoRⅠ这种特殊的识别能力叫做星活性，用EcoRⅠ*表示。星活性可造成位点切割机率不等，降解不完全。 影响因素：甘油浓度12-20%，酶与DNA比例，离子强度，45%聚乙二醇(PEG)，有机溶剂，8%二甲基亚枫，二价阳离子，12%乙醇。 2.1.2 限制性内切酶 是基因工程中的一项最基本技术,DNA、RNA检 测和分离的重要手段。 特点：快速、简便、样品用量少、灵敏度高以及一次测定中可获多种信息。 根据分子大小与构型形成的分子筛效应,适于分离200bp-50Kb的DNA片段。 2.1.3 琼脂糖凝胶电泳检测DNA 2.1.3 琼脂糖凝胶电泳 [实验原理] DNA分子在高于等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。DNA分子在琼脂糖凝胶中时有电荷效应和分子筛效应。 在一定的电场强度下, DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应.具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样.凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的DNA, 也可以分离分子质量相同,但构型不同的DNA分子。 影响泳动速率的因素 电场强度