双向电泳详解演示文稿.pptVIP

增加样品溶解性的手段 一些疏水蛋白尤其是膜蛋白很难溶解，为了促进 其溶解，常加入一些增溶剂如变性剂、表面活性 剂、还原剂等。 1.变性剂 ：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展，将其疏水中心充分暴露，降低接近疏水残基的能量域。其典型代表是尿素和硫尿。 尿素是2D中最常用的变性剂，其作用是可逆的，在凝胶中的浓度必需保持在8mol/L以上。过低则达不到完全溶解样品的目的，当尿素与硫脲结合使用时，极大地提高了膜蛋白的溶解。由于硫脲难溶于水，高浓度的尿素能促进硫脲的溶解，因此2mol/L硫脲常在5-7mol/L尿素浓度下使用，硫脲浓度大于2mol/L会降低等电聚焦(IEF)分辨率。 当前24页，共70页，星期二。 2.表面活性剂 ： 经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后，还常需至少一种表面活性剂来溶解疏水基团。强离子型去垢剂如SDS会影响蛋白所带的电荷，不适合在等电聚焦中使用，因此尽量选用非离子型或两性离子表面活性剂，从而保证蛋白质仅依靠其自身的电荷进行移动，其中CHAPS和SB3-10最好。 3.还原剂： 在变性剂和表面活性剂联用条件下，加用还原剂可使已变性的蛋白质展开更完全，溶解更彻底。常用含自由巯基的DTT或β-巯基乙醇，以及不带电荷的三丁基膦（TBP)进行还原。 当前25页，共70页，星期二。 4.起载体作用的两性电解质 即便在变性剂和表面活性剂存在的情况下，某些蛋白质也需要在盐离子作用下才能保持其处于溶解状态，否则这些蛋白质在其处于PI点时会发生沉淀。 Carrier ampholytes的作用于捕获样品中的少量盐分，从而保证蛋白质的溶解性。应用时，两性电解质的浓度应小于0.2%（W/V)。浓度过高会使IEF的速度降低。另外，为了保证实验的精确性，在选择不同PH范围的IPG胶条时，也应使两性电解质的pH值与之相符合。 当前26页，共70页，星期二。 去除杂质—— 关键是尽量不丢失蛋白和减少蛋白修饰 在样品中常常会含有像核酸、多糖、去污剂和代谢物等非蛋白杂质，需要去除，否则会影响双向电泳的结果，这个过程有时会造成蛋白的丢失以及蛋白的化学修饰和解聚，特别是后者会导致双向电泳图谱中蛋白点的增多（由于电荷的改变），所以操作中要多加注意。 1.核酸的清除 对电泳的影响：增加样品粘度、与蛋白质形成复合物后会出 现假象迁移和条纹。 解决的方法：用适量纯的不含蛋白酶的核酸内切酶进行降解，或是利用合成载体两性电解质（SCA)同核酸结合形成复合物的能力，再通过超速离心来去除复合物。 2.多糖的清除 对电泳的影响：带负电的多糖会与蛋白形成复合物导致拖尾影响聚焦。 解决的方法：利用超离心和高pH,高离子强度和TCA等沉淀法。 当前27页，共70页，星期二。 3.去污剂的清除 对电泳的影响：SDS能与蛋白形成带负电的复合物，对等电聚焦影响大，需要清除。 解决的方法：用含载体的两性电解质或两性离子去污剂（CHAPS、Triton X-100或NP-40)溶胀液稀释，或者丙酮沉淀法。 4.盐离子和外源带电小分子的清除 对电泳的影响：样品中的盐会增加凝胶条的电导，使其无法达到设置的电流，从而影响蛋白质聚焦，带电小分子会引起水的流动，使胶条的一端肿胀而另一端变干，导致两端的酸、碱性蛋白无法聚焦，造成拖尾或丢失。 解决的立法：常用透析去除盐成份，TCA-丙酮沉淀法可以清除小分子。 当前28页，共70页，星期二。 定义： 等电聚焦电泳是一种利用有pH值梯度的介质， 分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。 将等电点不同的蛋白质混合物加入有pH值梯度的凝胶介质中，在电场内经过一段时间后，各组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH值位置上，最后，样品的各组分在各自的等电点聚焦成一条清晰而稳定的窄带。 06-05 净电荷与PH的关系曲线 第一向分离 等电聚焦电泳 当前29页，共70页，星期二。 等电聚焦电泳进行过程中 等电聚焦电泳结束后 （－） （－） 高pH 高pH 低pH 低pH 当前30页，共70页，星期二。 等电聚焦原理 蛋白质是两性分子，在不同的pH环境中可以带正电荷、负电荷或不带电荷。对每个蛋白质来说都有一个特定的pH，此时蛋白质的静电荷为零，此pH值即该蛋白质的等电点(pI)。将蛋白质样品加载至pH梯度介质上进行电泳时，它会向与其所带电荷相反的电极方向移动。在移动过程中，蛋白分子可能获得或失去质子，并且随着移动的进行，该蛋白所带的电荷数和迁移速度下降。当蛋白质迁移至其等电点pH位置时，其净电荷数为零，在电场中不再移动。 聚焦是一个与pH相关的平衡过程：蛋白质以不同的速率靠近并最终停留在它们各自的pI值；在等电聚焦过程中，蛋白质可以从各个方向移动