亲和色谱精讲PPT课件.ppt

二、金属螯合色谱 原理 His Cys Trp能与某些金属离子形成复合物，若将金属离子固定，可将含这些外露AA的Pr吸附。 固定方法： 将环氧活化型Sepharose6B与金属螯合剂偶联成配基，再用金属离子处理。如… 洗脱：采用增加I或降低pH或加入EDTA 原理 * 原理 蛋白质分子表面的组氨酸咪唑基、半胱氨酸巯基和色氨酸吲哚环能与铜、锌、镍离子间形成稳定的螯合物 * * * 金属螯合亲和层析材料 载体 Sepharose 4B或6B，亲水树脂 配体 亚氨基二乙酸（IDA）：3个配位基团 三（羧甲基）乙二胺（TED）：5个配位基团 金属离子 Cu2+ Ni2+ Zn2+ Co2+ Ca2+, Mg2+ * 金属螯合亲和层析实例 纯化带六聚组氨酸（6xHis）末端的基因重组酶NAD激酶 样品准备 重组NAD激酶表达菌离心，分散于起始缓冲液，超声破碎细胞，离心提取上清得粗酶液 层析材料 Ni-chelating，以亚氨基二乙酸作为配体的环氧乙烷活化琼脂糖凝胶，螯合离子为镍离子 * 装柱 10Vt 50mmol/L EDTA-0.5mol/L NaCl除去杂质，5Vt蒸馏水清洗，0.6Vt 0.1mol/L NiSO4固定金属离子 起始缓冲液 20mmol/L KPB, pH7.5、0.1mmol/L NAD、0.5mmol/L二硫苏糖醇、0.5mol/L NaCl、10mmol/L咪唑 加样、吸附、洗去杂质 洗脱液 10mmol/L→0.5mol/L咪唑梯度缓冲液解吸 清洗和再生 强螯合剂0.05mol/L EDTA ,0.5mol/L NaCl再生亲和柱，5Vt蒸馏水洗涤，储存于20%乙醇 * 蛋白质(mg) NAD激酶活性(U) 回收率(%) 比活(U/mg) 纯化倍数(×) 细胞提取液 880 11 100 0.0125 1 Ni-亲和层析 4.6 6.3 53.68 1.3679 107 * 四、有机染料亲和色谱 有机染料如蒽酮化合物和偶氮化合物具类似于NAD+的结构。一些需核苷酸类物质为辅酶的酶，对这些染料具一定亲和力。 * Dye-stuffs Cibacron Blue 3G-A mimics NADH * 染料配体亲和层析 以仿生染料，主要是三嗪染料作为配体的亲和层析 常用的染料有Cibacron blue F3GA（多芳香环的磺化物）和Procion Red HE3B，多以Sepharose作为载体，前者称蓝色Sepharose，后者称红色Sepharose 具有一定的阳离子交换作用，应适当提高缓冲液离子强度来减少非特异性吸附作用 * 原理 蓝色染料Cibacron blue F3GA在结构上与NAD+和NADP+很相似，用于纯化NAD+、NADP+依赖性酶，如各种激酶、磷酸酶、脱氢酶、DNA聚合酶、限制性核酸内切酶等 红色染料Procion Red HE3B用于纯化NADP+依赖性酶，如某些脱氢酶，以及其他非相关蛋白质，如干扰素、抑制蛋白、羧肽酶G、血纤蛋白溶酶原等，结合不仅依赖于特定基团，还依赖于离子键或疏水相互作用 * 材料 制备：偶联到6%交联琼脂糖（Sepharose CL-6B） 商品化染料亲和吸附剂 Red Sepharose CL-6B * 染料配体亲和层析实例 从Candida utilis中分离NADP+依赖型酶 吸附缓冲液：中性pH缓冲液 洗脱缓冲液： 专一性洗脱：含NAD+或NADP+的缓冲液 非专一性洗脱：增加离子强度至2M NaCl 或1M KCl * A：非吸附蛋白，B：6-磷酸葡萄糖脱氢酶，C：谷氨酸脱氢酶，D：谷胱甘肽还原酶，E： 6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶 * 五 凝集素亲和层析 凝集素是一类来自于霉菌、植物和动物的蛋白质，能可逆地、选择性地同特定的糖残基结合 不同的凝集素结合不同的糖分子 用于分离含糖基的化合物，如多糖、糖蛋白、糖脂、细胞内颗粒、细胞等 * 凝集素 分子量 亚基数目 特异性 洗脱糖类 所需离子 伴刀豆球蛋白A 55000 2/4 α-D-甘露糖 α-D-葡萄糖 α-甲基甘露糖 α-甲基葡萄糖 Ca2+ Mn2+ 扁豆凝集素 49000 2 α-D-甘露糖 α-D-葡萄糖 α-甲基甘露糖 α-甲基葡萄糖 Ca2+ Mn2+ 豌豆凝集素 49000 4(αβ) α-D-甘露糖 α-甲基甘露糖 蓖麻凝集素 120000 4 β-D-半乳糖 乳糖，半乳糖 蓖麻凝集素