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二、培养基的灭菌 微生物性质与数量 不同微生物种类耐热性有很大差距 生理时期上对数期耐热性较差 微生物数量越多耐热性越强 耐热个体出现机会多 传热和死角 培养基中的天然成分含菌较多 冷空气排除情况 原理：冷空气阻碍蒸汽传热且减小分压 当前30页，共69页，星期二。 二、培养基的灭菌 灭菌对象体积 不论在实验室还是在生产车间，灭菌体积越大，灭菌时间越长。 其他 如上磅下磅速度，发酵罐内部构造(实消)，搅拌的力度等都会对培养基灭菌效果产生一定的影响。 当前31页，共69页，星期二。 二、培养基的灭菌 （三）培养基灭菌时间的计算 分批灭菌 简化：不计升温与降温阶段所杀灭的菌数，实际时间较计算值略短。可以由式(5-2)求得。 例5-1 某发酵罐内装培养基40m3，在121℃下进行分批灭菌。设每毫升培养基中含耐热芽孢杆菌为2×105个，121℃时的灭菌速度常数 (5-2) 当前32页，共69页，星期二。 二、培养基的灭菌 为1.8 min-1。求理论灭菌时间（即灭菌失败机率为0.001时所需要的灭菌时间）。 解：N0=40×106×2×105=8×1012个 Nt=0.001个 k= 1.8 min-1 灭菌时间： 若考虑升温阶段(一般100℃以上)的杀菌贡献，则关键是估算出在这一阶段的平均热死速率常数km，就可根据这段时间tp计算出实际初始菌 当前33页，共69页，星期二。 二、培养基的灭菌 量Np，进而求出实际所需保温时间t。在这里由于现在普遍采用迅速降温的措施，时间短，所以在计算时一般不考虑降温的杀菌贡献。 若以芽孢为标准，则在计算热死速率常数k的式(5-4)中一般系数A可取1.34×1036s-1，△E可以取2.844×105 J/mol，则该式化为式 (5-5)。 (5-4) (5-5) 当前34页，共69页，星期二。 二、培养基的灭菌 利用式 (5-5)可求得不同灭菌温度下的速度常数，再以图解积分法求出温度效应总和，即可求出km： 则升温阶段结束时，培养基中残留菌数Np可从下式求得： (5-6) (5-7) 当前35页，共69页，星期二。 二、培养基的灭菌 则保温所需时间为： 利用式 (5-8)就可以计算考虑升温阶段的情况下的实际保温时间。 例5-2 在例5-1中，灭菌过程的升温阶段，培养基从100℃上升至121℃，共需15min，若升温阶段按3℃的梯度近似计算，求升温阶段结束时,培养基中的芽孢数和保温所需的时间。 (5-8) 当前36页，共69页，星期二。 二、培养基的灭菌 解：T1=373K T2=394K 由式 (5-5)可以分别求得各个温度梯度下的热死速率常数： 再由图解积分法 (梯形法)求得升温阶段总效应： =(k1△T+k2△T+…k7△T)+ (k2△T+k3△T +…k8△T)/2 ≈0.127 K/s T/K 373 376 379 382 385 388 391 394 /s-1 2.09×10-4 4.35×10-4 8.94×10-4 1.81×10-3 3.64×10-3 7.24×10-3 1.42×10-2 2.77×10-2 k·△T 6.27×10-4 13.05×10-4 26.82×10-4 5.43×10-3 10.92×10-3 21.72×10-3 4.26×10-2 8.31×10-2 当前37页，共69页，星期二。 二、培养基的灭菌 则升温阶段平均热死速率常数km为： 则升温阶段结束芽孢数Np为： 则保温时间t为： (s-1) (个) 当前38页，共69页，星期二。 二、培养基的灭菌 由此可见，考虑升温阶段的灭菌作用后，保温时间比不考虑的减少了14.9%。所以发酵罐体积越大，其分批灭菌的升温时间越长，升温阶段的对灭菌的贡献就越大，相应的保温时间就越短。 (min) 当前39页，共69页，星期二。 二、培养基的灭菌 连续灭菌 连续灭菌的理论灭菌时间的计算仍可采用对数残留定律，如果忽略升温的灭菌作用，则灭菌保温的时间： 式中： C0 为单位体积培养基灭菌前的含菌数，个/mL； Ct 为单位体积培养基灭菌后的含菌数，个/mL。 (5-9) 当前40页，共69页，星期二。 二、培养基的灭菌 例5-3 若将例5-1中的培养基采用连续灭菌，灭菌温度为131℃，此温度下灭菌速度常数为15min-1，求灭菌所需的维持时间。 解：C0= 2×105 个/mL Ct= 1 /40×106×103= 2.5×10-11 个/mL 所以维持时间t