细菌内毒素经典简介及检测方法.pptx

细菌内毒素经典简介及检测方法 ;一、概念及相关知识;1942年,美国药典首次收载热原检查法,中国药典自第一版(1953年版)起收载。 所有注射用药品(肌肉注射、静脉注射)都要经过热原检查。 热原检查法的局限性: 1、重现性差。 2、对药物引起的增加、抑制作用无法控制。 3、不同细菌产生的热原质的致热域有差别。 4、非定量反应。 尽管不排除有其他热原物质存在,但细菌内毒素是最主要的热原物质。;细胞壁结构: 肽聚糖 脂蛋白 革兰氏阳性菌 革兰氏阴性菌 外膜 细菌细胞壁外膜中的脂多糖(LPS)。当细胞磷壁酸 脂多糖 细菌内毒素:革兰氏阴性壁外膜结构完整时不具备生物活性,只有当细菌死亡,脂多糖脱落才显示出内毒素活性。 脂多糖结构:多糖O抗原＋核心多糖＋类脂A;内毒素的量值: 1、内毒素单位(EU) 1982年FDA将当时美国代号为EC－2的内毒素标准品规定为5EU/ng。1983年内毒素单位(EU)被USP正式引用。 2、国际单位(IU) WHO先后两次组织协作标定,建立内毒素国际标准品,其中第二批内毒素国际标准品适用于所有内毒素检查法,且明确1IU＝1EU。;鲎:一种古老的栖身于沿海的海洋生物,节肢动物门,在我国主要分布于浙江、福建及两广的沿海一带。 鲎试剂:利用鲎血液中的变性细胞,经裂解液和机械方式促使细胞破裂而提取到的一种细胞溶解物,能与极微量的细菌内毒素形成特异凝胶反应,反应的速度和凝胶的牢固程度与内毒素浓度有关,是体外检测内毒素的敏感试剂。;鲎试剂与内毒素反应机理;细菌内毒素检查法;二、细菌内毒素检测之凝胶法;实验材料及用具 1、仪器 ;试剂 1、鲎试剂:具有国家颁发的批准文号 2、内毒素工作标准品 3、内毒素检查用水 4、三效热原灭火剂 5、75％乙醇 常用英文缩写 BET:细菌内毒素检查 BET水:细菌内毒素检查用水 MVD:供试品最大有效稀释倍数 NC:阴性对比 MVC:供试品最低有效浓度 PC:阳性对比 λ:鲎试剂灵敏度 L:供试品细菌内毒素限值;灵敏度复核试验:每批鲎试剂用于检测前都必须进行灵敏度复核。 试验举例:内毒素工作标准品为100EU/支; 待测鲎试??灵敏度λ＝0、25EU/ml。 1、制备内毒素标准溶液:取工作标准品一支,轻弹瓶壁使粉末落入瓶底,用砂轮在瓶颈出划痕,用75％酒精擦拭后启开,加1mlBET水溶解,封口膜封住,置漩涡振荡器上混匀15min后进行稀释,步骤如下(箭头下方为加入BET水量):;;2、溶解鲎试剂:若鲎试剂为0、1ml装量,则取18支,每支加入0、1mlBET水溶解;若鲎试剂装量大于0、1ml,则取若干支,按标示量加入 BET水溶解,再取0、1ml分装于标准玻璃试管(10mm×75mm),将试管按如下形状排列。 3、加样:每列每支加入相应浓度的内毒素标准品溶液各0、1ml,第五列加入BET水0、1ml。;反应及结果判断:加样结束后用封口膜封口,轻振动混匀,置37 ℃水浴中保温60±2min,将每管拿出缓缓倒转180°,凝胶不变形为“＋”,凝胶不能保持完整为“－”。 当2、0λ四支管都为阳性,0、25λ四支管都为阴性时,试验成立,按下面底公式计算复核的灵敏度λc : λc＝lg-1(∑X/4) (X:反应终点浓度的对数值。) 当0、 5λ≤λc ≤2、0λ时,鲎试剂灵敏度复核合格,检测时仍以标示灵敏度λ为准。;举例: 设待复核的鲎试剂标示灵敏度λ为0、125EU/ml:;样品内毒素检查 1、供试品最大有效稀释倍数的计算: C·L MVD＝ λ λ:测试用鲎试剂灵敏度标示值(EU/ml)。 L:供试品细菌内毒素限值。 C:供试品浓度或供试品复溶后所得样品浓度。 当L单位为EU/ml(溶液)时,C的单位为1ml/ml; 当L单位为EU/mg或者EU/u时(抗生素原料),C的单位为mg/ml或者u/ml。;2、供试品溶液稀释:将供试品稀释,稀释倍数为MVD。 含2λ内毒素标准品的供试品溶液(PPC)的制备: 3、加样:取鲎试剂8支,每支加入BET水0、1ml溶解。2支为样品管,加入样品液0、1ml;2支加入阴性对比管,加入BET水0、1ml;2支为阳性对比管,加入2 2λ浓度的内毒素标准品溶液0、1ml;2支为样品阳性管,加入0、1ml含2λ内毒素标准品的样品溶液。