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KSHVRTA上调宿主细胞Bcl2表达的分子的方式分析 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：KSHVRTA上调宿主细胞Bcl2表达的分子的方式分析 1 1 材料与方法 2 2 结果 4 3 讨论 6 文2：低分子肝素对大鼠脑局灶性缺血再灌注后Bcl2Bax表达的影响及保护作用 8 1材料和方法 8 参考文摘引言： 12 原创性声明（模板） 13 文章致谢（模板） 14 正文 KSHVRTA上调宿主细胞Bcl2表达的分子的方式分析 文1：KSHVRTA上调宿主细胞Bcl2表达的分子的方式分析 卡波氏肉瘤病毒（Kaposiss Sarcoma-Associated Herpesvirus，KSHV）发现于1994年，又称γ-疱疹病毒8型。该病毒是卡波氏肉瘤（Kaposiss Sarcoma）、原发性渗出性淋巴瘤（primary effusion lymphoa，PEL）、多中心卡氏病（multicentric Castlemans diease）的病原体[1]。KSHV病毒基因组呈双链DNA，有两种不同的生活周期：潜伏性感染（lantent infection）与裂解性复制（lytic replication）。这两种感染方式存在反馈性调节并可以相互转化[2-3]。在潜伏性感染时，病毒以游离体的形式存在，只表达ORF73、K12、ORF72、ORF71、K15等少数潜伏性基因，有利于建立持久性的感染[4]。在缺氧或TPA诱导等因素作用下病毒呈裂解性感染，以级联反应的形式激活一系列病毒编码基因，并导致宿主细胞的死亡及病毒子的释放，传播至新的宿主细胞[5-6] KSHV复制转录激活因子（replication and tracription activator，RTA）是ORF50编码的一种即刻早期蛋白，是促使病毒从潜伏性感染向裂解性感染转变的关键调控因子。无论是外源性还是内源性来源引起的RTA表达增高，均可介导病毒裂解性基因的级联表达[7]。一些化学物质如TPA、butyrate等可诱导KSHV的溶解性感染[8]。KSHV阳性细胞经TPA诱导后1 h就可检出RTA的表达[9]。通过Blast比对，笔者发现抗凋亡基因Bcl-2的P1启动子上游区域含有9个CCN9GG样序列，这里N可以为任何碱基。这些CCN9GG样序列为近年来新发现的RTA反应元件（RTA respoive elements，RREs）[10]。KSHV RTA能否与这些RRE相互作用并调节宿主细胞Bcl-2基因表达？这引起了研究者的极大兴趣。本研究主要探讨KSHV RTA上调宿主Bcl-2的分子机制。 1 材料与方法 质粒 pcDNA-RTA编码全长RTA的真核表达载体。pGL3-Bcl-2为含Bcl-2基因全长启动子的荧光素酶报告质粒。pGL3-△RREs，pGL3-△P1，pGL3-△P2是采用PCR定点突变技术构建的报告质粒（引物见表1），它们分别突变了Bcl-2基因全长启动子中的9个RRE、启动子P1与启动子P2。构建pGL3-△RREs时，将PCR扩增片段（Bcl-2启动子核苷酸-1563～+1）插入pGL3载体SmaI/HindⅢ双酶切位点处；构建pGL3-△P2时，将启动子片段（-2744～-680）插入pGL3载体SmaI/HindⅢ双酶切位点处；构建pGL3-△P1时，先将启动子片段（-346～+1）插入pGL3载体MluI/HindⅢ双酶切位点处（pGL3-P2），再将片段（核苷酸-2867～-1545）插入pGL3-P2的MluI/HindⅢ双酶切位点处。 抗体与细胞 RTA抗体用杂交瘤技术制备，由上海巴斯德研究所蓝柯实验室提供。Bcl-2小鼠单克隆抗体购自Santa Cruz公司，GAPDH抗体为Novus Biologicals公司产品，耦联IR Dye 800的羊抗鼠IgG购自Rockland公司。 HEK 293是原代人胚肾细胞转染腺病毒DNA的永生化细胞。BJAB为KSHV和EBVA均阴性的B细胞淋巴瘤细胞系，DG-75为未感染KSHV的Burkitts淋巴瘤细胞。BC3和BCBL1是感染KSHV的人体腔淋巴瘤细胞系。细胞培养的方法参见有关文献[11] 细胞转染及KSHV的诱导 采用Bio-Rad公司的Gene Pulser电穿孔仪进行细胞转染，电穿孔转染的实验方法在文献中已有介绍[12]。用20 ng/mL TPA、 mM butyrate诱导KSHV，未经诱导处理的细胞作为对照组。所有细胞均在诱导后培养48 h收集。 Western blot 细胞收集后加入RIPA缓冲液裂解，用bradford比色法测定蛋白质浓度。取相同质量的细胞