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经静脉移植骨髓间质干细胞治疗脑梗死 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：经静脉移植骨髓间质干细胞治疗脑梗死 1 1 材料与方法 2 2 结果 4 3 讨论 6 文2：经静脉移植骨髓间质干细胞治疗脑梗死 7 1 材料与方法 8 2 结果 10 参考文摘引言： 11 原创性声明（模板） 12 文章致谢（模板） 12 正文 经静脉移植骨髓间质干细胞治疗脑梗死 文1：经静脉移植骨髓间质干细胞治疗脑梗死 研究发现，骨髓间质干细胞(MSC)在体内外特定条件的诱导下可以分化表达神经细胞标志物，MSC脑移植对急性缺血性神经损伤的功能恢复有一定治疗作用[13]。在脑梗死的干细胞移植治疗过程中，如何移植干细胞到需要的病灶部位而又不对神经组织造成机械损伤，这个问题在国内的类似研究中显得较为突出，如采用脑立体定向注射的方法，本身就对脑组织结构造成损伤，而且植入细胞的分布不均匀[46]。笔者从静脉路移植MSC，观察MSC在脑梗死灶的分布、迁移与分化情况。 1 材料与方法 材料 清洁级雄性SD大鼠，2~3月龄，体质量280~320 g[福建医科大学实验动物中心，实验动物质量许可证号:SGXK(闽)]。αMEM培养液(minimum essential medium，Alpha Modified，美国Gibco公司);胎牛血清(FBS，美国Hyclone公司);FicollPaque淋巴细胞分离液(美国Pharmacia公司);%胰蛋白酶(Trypsin 1∶250，美国Ameco公司);荧光染料(cell tracker orange，CTO，美国Invitrogen公司);小鼠抗大鼠巢蛋白(Nestin)多克隆抗体、小鼠抗大鼠神经丝蛋白(NF200)多克隆抗体及兔抗大鼠神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)多克隆抗体(武汉BOSTER公司);SABCFITC免疫组织化学试剂盒(武汉BOSTER公司)，PV6001/2试剂盒(北京中山试剂公司) 方法 大鼠骨髓间质干细胞(rat mesenchymal stem cells，rMSC)的分离、扩增、保存、表面标志抗原鉴定与标记 参照文献[7]。大鼠腹腔注射45 mg/100 g戊巴比妥钠麻醉。取骨髓加于FicollPaque淋巴细胞分离液上离心，吸取中间单核细胞层，洗涤，调整细胞密度后按×104cm-2接种于培养瓶。培养液含15%FBS、青霉素100 U/mL，链霉素100 mg/L。置37 ℃、体积分数为的CO2、饱和湿度的孵箱内培养。在每次培养传代时部分分装冻存，部分继续传代，传至第5代。 .1 细胞冻存 将消化下的细胞悬液离心，调整浓度为(1~3)×106mL-1，分装于1 mL的冻存管，置4 ℃ 40~60 min后，再置-20 ℃ 2 h，于-80 ℃冰箱过夜，最后置液氮中。复苏细胞时将冻存管迅速放入37 ℃温水中融化，加培养液3 mL混悬，离心，弃上清，加入含20%FBS αMEM培养液，接种于培养瓶中培养。 .2 流式细胞术检测 调整第4代rMSC细胞浓度为(1~3)×106 mL-1，分装6管，每管100 μL，每2管1组。分别加入CD34PE与CD45FITC抗体。于4 ℃避光孵育30 min后检测。 .3 荧光染料CTO标记rMSC 参照文献[8]。 将10 mmol/L CTO二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)贮存液配制成1 μmol/L标记液。当rMSC长满瓶底时加入标记液5 mL，37 ℃孵育45 min，吸掉标记液，加入无血清培养基5 mL，37 ℃孵育30 min，于荧光显微镜下观察细胞均发出红色荧光。 线栓法制备大鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)模型 参照文献[9]方法并改进。大鼠2%戊巴比妥钠(45 mg/kg)腹腔麻醉，仰卧固定于手术台，分离左侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)，结扎并游离ECA及其分支，沿ICA向下分离翼腭动脉(PPA)，用线将其悬吊。夹闭CCA和ICA，于ECA残端起始部剪一小口，由此口轻轻插入直径 mm末端成球状的尼龙线，至大脑中动脉(MCA)起始部。在ECA处结扎线的末端，去除悬吊线，松开夹闭CCA的动脉夹。尼龙线插入深度从CCA分叉处开始计算约(18±)mm。MCA血流阻断2 h后再次麻醉，重新暴露切口，缓慢抽出尼龙线使其球端回到ECA内，即恢复MCA血供，实现再灌注。 分组与移植 将模型鼠32只随机分为4组，每组8只，分别于再灌注后24 h经尾静脉移植:PBS 1 mL作为对照组（分为A、B组)，rMSC悬液1 mL作为移植组(分为C、D组)。其中A、C组于1周后取脑，