ＭＲＳＡＰＢＰ２ａ单克隆抗体乳胶凝集检测法的建立.doc

ＭＲＳＡＰＢＰ２ａ单克隆抗体乳胶凝集检测法的建立 正文 ＭＲＳＡＰＢＰ２ａ单克隆抗体乳胶凝集检测法的建立 文1：ＭＲＳＡＰＢＰ２ａ单克隆抗体乳胶凝集检测法的建立 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ，ＭＲＳＡ）是全球性引起医院内感染最重要的耐药致病菌之一［１，２］，对常用的包括甲氧西林在内的多种抗生素广泛耐药，其主要耐药机制是由于染色体ｍｅｃＡ基因［３］编码产生了对β-内酰胺类抗生素低亲和力的青霉素结合蛋白２ａ（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ２ａ，ＰＢＰ２ａ）所致，由于其所致感染病情复杂、治疗棘手、死亡率高，因此建立快速、准确地诊断ＭＲＳＡ感染的方法成为各国学者关注与研究的的热点。Ｎａｋａｔｏｍｉ和Ｓｕｇｉｙａｍａ［４］于１９９８年报道一种快速检测ＭＲＳＡ的乳胶凝集试验（Ｌａｔｅｘ ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ，ＬＡＴ），其原理是抗ＰＢＰ２ａ单克隆抗体致敏的乳胶颗粒与ＭＲＳＡ的膜蛋白提取物作用，如产生肉眼可见的凝集颗粒，证实有ＰＢＰ２ａ存在，以此判断该菌为ＭＲＳＡ。目前该方法国外已有试剂盒出售［５］，但尚无具有自主知识产权的国产试剂盒问世。本研究利用自行制备的针对ＰＢＰ２ａ的单克隆抗体，以化学交联法致敏羧化聚苯乙烯乳胶，对致敏条件进行探索和优化选择，建立了检测ＰＢＰ２ａ的乳胶凝集法，旨在为进一步制备ＭＲＳＡ快速鉴定试剂盒奠定基础。 １ 材料与方法 １．１ 材 料 ｐＥＴ-ｈｉｓ-ＰＢＰ２ａ转肽酶区表达质粒由本室构建，Ｎｉ-ＮＴＡ金属鳌合亲和层析柱为Ｎｏｖａｇｅｎ公司产品。１００ ｇ／Ｌ羧化聚苯乙烯乳胶为上海科欣生物公司产品；水溶性碳化二亚胺（ＥＤＣ）购自Ｓｉｇｍａ公司，－２０ ℃保存。其余试剂为分析纯。高速冷冻离心机为ＥＰＰＥＮＤＯＲＦ公司产品；７１７０全自动生化分析仪为日立公司产品。 １．２ 方 法 １．２．１ 重组ＰＢＰ２ａ转肽酶区蛋白制备 取含ｐＥＴ-ｈｉｓ-ＰＢＰ２ａ转肽酶区表达质粒的Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳ于含氨卞青霉素（１００ ｍｇ／Ｌ）ＬＢ培养液中３７ ℃ ２５０ × ｇ振摇至Ａ６００ｎｍ＝０．６，加ＩＰＴＧ（终浓度为０．６ ｍｍｏｌ／Ｌ）于３７ ℃继续振摇培养５ ｈ，离心收集菌体，８ ｍｏｌ／Ｌ的尿素变性后，过Ｎｉ-ＮＴＡ金属鳌合亲和层析柱，以ＳＤＳ-ＰＡＧＥ鉴定重组蛋白相对分子量（Ｍｒ）及纯度，并采取逐步降低尿素浓度梯度复性法复性，离心取上清，ＰＥＧ（２００００）浓缩后备用［６］ １．２．２ 抗ＰＢＰ２ａ单克隆抗体的制备 以重组ＰＢＰ２ａ转肽酶区蛋白为抗原，免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取免疫小鼠的脾细胞和ＮＳ-１骨髓瘤细胞在ＰＥＧ（４０００）作用下进行细胞融合，筛选和４次克隆化，获得２株特异性好、亲和力高、可稳定分泌抗ＰＢＰ２ａ ｍＡｂ的杂交瘤细胞。取其中１株杂交瘤细胞（１ × １０６）接种于已注射降植烷的ＢＡＬＢ／ｃ小鼠腹腔中制备腹水，采用正辛酸-饱和硫酸铵法纯化腹水中抗ＰＢＰ２ａ单克隆抗体。取０．５ ｍＬ小鼠腹水用ＶＢＳ缓冲液稀释至２ ｍＬ，混匀后加入３０ ｍｇ ＳｉＯ２，置于室温中搅动３０ ｍｉｎ，４ ℃ １４ ０００ × ｇ离心１５ ｍｉｎ。取上清加入８ ｍＬ醋酸缓冲液，在缓慢搅拌过程中，室温下逐滴滴加正辛酸３３ μＬ，使其终浓度为３．３％，４ ℃，１４ ０００ × ｇ离心１５ ｍｉｎ；取上清用０．０１ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ调ｐＨ至７．０；再加入ＰＢＳ（０．０１ ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．４）６ ｍＬ以及４５％硫酸铵溶液６ ｍＬ，４ ℃，１４ ０００ × ｇ离心１５ ｍｉｎ；弃上清，取沉淀加入适量ＰＢＳ，装于透析袋内，对５０倍体积的ＰＢＳ（０．０１ ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ ７．４）４ ℃，透析２４ ～ ４８ ｈ，中途换液数次。将透析物进行蛋白量的测定，并于４ ℃保存［７］ １．２．３ ＰＢＰ２ａ乳胶凝集法的建立 ①致敏方案［８］：取０．４ ｍＬ的羧化聚苯乙烯乳胶放入离心管中，加入１ ｍＬ碳酸缓冲液（０．１ ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ ９．６）１４ ０００ × ｇ离心１０ ｍｉｎ，倾去上清液，反复洗３遍，再加入１ ｍＬ ＰＢＳ溶液１４ ０００ × ｇ离心１０ ｍｉｎ，倾去上清液，反复洗３遍，接着加入水溶性碳化二亚胺（ＥＤＣ）０．５ ｍＬ和ＰＢＳ ０．５ ｍＬ，室温下搅动３０ ｍｉｎ，再用硼酸缓冲液（０．０１ ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ ８．０）１４ ０００ × ｇ离心１０ ｍｉｎ，倾去上清液，反复洗３遍。再加入１ ｍＬ硼酸缓冲液制成胶乳悬液，再加入提纯的抗ＰＢＰ２ａ单克隆抗体０．１ ｍＬ，室温下于摇床上摇动适当时间。最后加入终止剂甘氨酸溶液（０．１ ｍｏｌ／Ｌ） ５０ μＬ，搅动３０ ｍｉｎ，１４ ０