益气养阴方对顺铂诱导HepG2细胞Survivin表达的影响.doc

益气养阴方对顺铂诱导HepG2细胞Survivin表达的影响 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：益气养阴方对顺铂诱导HepG2细胞Survivin表达的影响 1 1 材料与仪器 2 2 方法 2 3 结果 4 4 讨论 5 文2：益气养阴方对小鼠肝癌血道转移的影响 6 1 材料 7 2 方法 7 3 结果 8 4 讨论 9 参考文摘引言： 11 原创性声明（模板） 12 文章致谢（模板） 12 正文 益气养阴方对顺铂诱导HepG2细胞Survivin表达的影响 文1：益气养阴方对顺铂诱导HepG2细胞Survivin表达的影响 益气养阴方是我们多年临床应用的有效验方，长期的临床实践证明其对原发性肝癌有良好的辅助治疗作用，尤其是与介入化疗等结合，能提高化疗的疗效，延长患者的生存期和改善生活质量，其作用的机制尚未被充分阐明。本研究通过血清药理学的方法，观察本方的含药血清联合化疗药顺铂(DDP)对肝癌HepG2 Survivin表达的影响，从而探讨本益气养阴方与化疗合用治疗肝癌的协同增效作用的相关机制。 1 材料与仪器 动物和细胞株雄性SD大鼠，体质量(253±18)g，由苏州大学实验动物中心提供。HepG2人肝癌细胞株购自上海生化研究所，本实验室自行保存传代备用。 药物和试剂RPMI1640培养基、小牛血清购自Gibcol公司;兔抗人survivin多克隆抗体和鼠抗人β-actin单克隆抗体为Neomarke公司产品;SP免疫化学检测试剂盒、羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG购自北京中山生物公司;苯甲基磺酰氟(PMSF)和Aprotinin购自Roch公司;ECL显影试剂为Pierce 公司产品;DDP购自江苏豪森药业公司。其他化学试剂均为进口或国产分析纯产品。益气养阴方中药饮片购于苏州大学附属第一医院中药房。 仪器和设备荧光倒置显微镜(日本Olipus公司);CO2培养箱(德国Heraeus公司);超净工作台(苏州净化设备厂);分析天平(美国sartorius公司);纯水装置(美国Miliproe公司);台式高速低温离心机(德国Beckman公司);垂直电泳仪(北京六一仪器厂);半干转移仪(美国Bio-Rad公司);恒温摇床(中国科学院武汉科学仪器厂);GIS凝胶成像分析系统(美国UVP公司) 2 方法 药物制备及剂量益气养阴中药复方由太子参、生黄芪、炒白术、女贞子、山茱萸生药按组方比例组成。将上述中药饮片置煎煮容器内，加相当药材量5倍的冷水浸泡1 h，煮沸30 min，过滤;再加3倍量水继续煎煮20 min，过滤，合并两次滤液，浓缩后，用蒸馏水稀释成含生药 g/ml的水煎剂，然后分装，4℃保存待用。根据人和动物体表面积折算的等效剂量比率表，设定灌胃的剂量为30 g/(kg·d)(相当于成人常用临床剂量的6倍)。对照组给予等量生理盐水。 含药血清的制备将大鼠随机分为空白对照组和含药血清组，每组8只，含药血清组将上述剂量的中药水煎剂分成每日上午9时和下午15时两次灌胃给药，空白对照组给予等量生理盐水，采血前连续灌胃3天，末次灌胃前禁食12 h，在末次给药后1 h时采血[1]。采血方法：戊巴比妥钠麻醉，无菌条件下自下腔静脉采血，静置4 h，4℃，离心3 000 min×20 min，分离血清，同种条件药物血清混匀，56℃， 30 min灭活，-20℃保存备用。采集的血清分为空白对照组血清和含药组血清。 细胞培养及处理配置RPMI 1640培养基：取NaHCO3 2g，谷氨酰胺，Heps 1g，置烧杯中，加ddH2O 700～800 ml，用磁力搅拌器充分搅拌使其完全溶解，调节pH 值在～，加适量ddH2O 至1 000 ml，过滤除菌，备用。细胞用含10%小牛血清的RPMI 1 640常规培养，实验所用细胞均处在对数生长期。 实验分组分为①空白对照组：加入10% 空白对照组血清及等量生理盐水;②含药血清组：加入10%含药组血清及等量生理盐水;③DDP组：加入2 μg/ml DDP和10%空白对照组血清;④DDP组+含药血清组：加入2 μg/ml DDP和10%含药组血清。 检测凋亡抑制蛋白survivin的表达 SP法免疫细胞化学染色法取对数生长期的HepG2细胞，接种于6孔板内，爬片，用含2%H2O2的50%甲醇中固定，风干，血清封闭，加入survivin一抗，4 C过夜，加二抗，DAB显色。光学显微镜下观察结果。用Imagepro-Plus软件分析计算照片的光密度值以代表survivin蛋白表达量。 Western blot技术检测Survivin的蛋白表达三去污剂法配制三去污剂，临用前加入100 μg/ml 苯