PCR技术的原理及应用.ppt

PCR技术的原理及应用;;;;;;Kary B. Mullis;;基因组DNA;;引物;94℃变性;;Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus);72℃;;;;;;;;;; 实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR在医学和科研中的应用; 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 ;常 规 PCR技术： 对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析。无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。;实时定量PCR技术：;如何对起始模板定量？;30;实时荧光定量PCR 原理 -------- 扩增曲线;实时荧光定量PCR 原理 -------荧光阈值;实时荧光定量PCR 原理 -------Ct值;实时荧光定量PCR 原理 -------Ct值的重现性;实时荧光定量PCR 原理 --------- 定量原理;实时荧光定量PCR 原理 --------- 定量原理;实时荧光定量PCR 原理 --------- 标准曲线;确定未知样品的 C(t)值 通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量;;非特异性荧光标记： 1、 SYBR Green Ⅰ 特异性荧光标记： 2、TaqMan 3、Molecular Beacon 4、Amplisensor;;SYBR Green Ⅰ法;实时荧光定量PCR原理 SYBR Green I 工作原理;实时荧光定量PCR原理 SYBR Green I 熔解曲线分析;实时荧光定量PCR原理 SYBR Green I 熔解曲线分析;SYBR Green Ⅰ法 融解曲线分析;Cycle number;;SYBR GreenⅠ 法 应用范围;SYBR GreenⅠ 法 优缺点 ;本单位目前开展的工作;实时荧光定量PCR 方法2 -------TaqMan法;与目标序列互补;;TaqMan 法 PCR反应的建立;已肝病人血液中HBV的绝对定量 目的：利用核酸检测，缩短检验时间，提高灵敏度，为诊断用药提供依据 方法：从血液中提取病毒DNA，扩增病毒基因，以TaqMan探针进行检测 设置对照：浓度为106、105 、104 、103 的标准样品各一个，设阴性和空白对照 实验步骤：提取HBV DNA 设计特异引物 设计TaqMan探针并标记探针 扩增程序 结果：获取血液样品中HBV DNA的精确copy数;数据分析;TaqMan法 应用范围;TaqMan法 优缺点;实时荧光定量PCR 方?? 3 -- Molecular beacon 法(分子信标);标记荧光的发夹探针 环与目标序列互补 茎由互补配对序列组成;Molecular beacon (分子信标) 工作原理;Molecular beacon (分子信标) 应用范围 ;Molecular beacon (分子信标) 优缺点;几种方法总结;实时荧光定量PCR的实验设计和数据处理;绝对定量与相对定量;实时荧光PCR绝对定量方法;使用实时荧光定量PCR进行绝对定量的优势;实时荧光相对定量;;;;;;;;;;;;;83;此课件下载可自行编辑修改，供参考！ 感谢您的支持，我们努力做得更好！