CPVBJ1株的分离及犬细小病毒VP2基因序列研究.doc

CPVBJ1株的分离及犬细小病毒VP2基因序列研究 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：CPVBJ1株的分离及犬细小病毒VP2基因序列研究 1 1、材料与方法 2 2、结果 5 3、讨论 7 文2：猪流行性腹泻病毒ＨＢ２０１６０２株的分离鉴定及Ｓ１基因序列分析 9 参考文摘引言： 10 原创性声明（模板） 12 文章致谢（模板） 12 正文 CPVBJ1株的分离及犬细小病毒VP2基因序列研究 文1：CPVBJ1株的分离及犬细小病毒VP2基因序列研究 犬细小病毒病是由犬细小病毒引起的犬的一种传染病，CPV是一种具有高度传染性的无囊膜的单链DNA病毒，可在家犬、猫和几种野生食肉动物中引起急性胃肠炎[1，2]。未接种疫苗的幼犬患病率较高，患病犬如果治疗及时，病死率在9%左右，如果治疗不及时，病死率可达91%左右，是目前危害犬类健康的最为严重的传染病之一[3，4] CPV最早在1977年由美国学者发现，为了与犬微小病毒相区别，在1978年命名为CPV-2[3，5]。我国最早是在1982年由梁士哲等[6]发现并报道该病。随后在我国的很多地方开始流行，并由现在的CPV-2c、CPVNew-2a和CPVNew-2b逐渐替代了原来的CPV-2、CPV-2a、CPV-2b，目前CPV-2c在中国的吉林、北京、山东、河南、广西和江苏已有报道[7，8，9，10，11，12，13]。CPV基因组全长5200nt，包括3个结构蛋白(VP1、VP2和VP3)和2个非结构蛋白(1和2)，其中VP2是该病毒的主要抗原蛋白，占整个衣壳蛋白的90%[14]。该病毒自发现至今只有1个血清型，但随着病毒的演变从发现至今共出现了6个抗原亚型CPV-2、CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c、NewCPV2a、NewCPV2b，并且不同毒株之间的抗原性也略有差异[15，16，17，18] 本研究在对VP2基因进行分析的基础上，对鉴定为NewCPV2a的北京毒株进行分离和病毒相关特性鉴定，有助于了解和掌握目前CPV的流行情况，为更好地防控CPV提供参考。 1、材料与方法 材料 临床样品来自北京和山东两地的宠物医院，病犬临床症状为呕吐、腹泻等，临床疑似为CPV感染，同时采集病犬的粪便样品备用。 F81细胞，本实验室保存;CPV单克隆抗体，INGENASA公司产品;Goatanti-MouseIgG(H+L)HighlyCross-AdsorbedSecondaryAntibody，FITC(货号A16079)，英潍捷基(上海)贸易有限公司产品;2×EsTaqMasterMix，康为世纪生物制品有限公司产品;粪便基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA片段回收试剂盒、Top10感受态细胞和细菌基因组DNA提取试剂盒，天根生化科技有限公司产品;DNA标准DL2000，TaKaRa有限公司产品;DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶、双抗，英潍捷基(上海)贸易有限公司产品;透析袋，Calbiochem公司产品;蛋白电泳缓冲液、TEMED，索莱宝公司产品。 3111型细胞培养箱，美国FormaScientific公司产品;Centrifuge5430R型低温离心机、Mastercyclernexusgradient梯度PCR仪，德国Eppendorf公司产品;NikonEclipseTi-U型倒置荧光显微镜，日本Nikon公司产品;Mini-PROTEANⅢ型蛋白电泳系统、GelDoc2000凝胶成像系统，Bio-Rad公司产品;OptimaLE-80K型超速离心机，美国BeckmanCoulter公司产品。 方法 用DMEM将收集的粪便样品进行10倍稀释后，按照天根生化科技有限公司的粪便基因组提取试剂盒说明书提取病毒的DNA，PCR扩增VP2全基因，反应结束后，将PCR产物经10g/L琼脂糖凝胶检测。VP2全基因扩增用引物见表1。 根据天根生化科技有限公胶回收试剂盒回收目的片段，将其克隆入pMD19-T载体中，16℃连接过夜，将连接产物转化大肠埃希菌()DH5α感受态，涂布氨苄抗性的固体LB平板，在37℃恒温培养箱中培养12h。挑单个菌落接种至氨苄抗性液体LB培养基，在37℃、180min的水平恒温摇床中培养14h，进行菌液PCR，将阳性克隆菌液送至北京擎科新业生物技术有限公司测序，并利用MegAlign软件将VP2基因序列与GenBank中已有的VP2序列进行比对。 表1扩增用引物序列 将序列测定为CPVNew-2a的粪便样品在4℃、3000min离心20min，取上清，经μm微孔滤膜过滤除菌后备用。从液氮罐中取出F81细胞，快速置于37℃水浴锅，将融化后的细胞液加入到含有100mL/LFBS