探究如何构建3种常见的CD36基因突变质粒.docVIP

探究如何构建3种常见的CD36基因突变质粒 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：探究如何构建3种常见的CD36基因突变质粒 1 1、材料与方法 2 2、结果 4 3、讨论 6 文2：农安县常见的3种玉米施肥技术 7 一、常规肥料(二铵+尿素+钾肥+锌肥)分期施肥技术 8 二、复合(混)肥料分期施肥技术 8 四、一次性施肥的注意事项 9 参考文摘引言： 10 原创性声明（模板） 11 文章致谢（模板） 11 正文 探究如何构建3种常见的CD36基因突变质粒 文1：探究如何构建3种常见的CD36基因突变质粒 高分辨率熔解曲线分析方法因具有操作简便、速度快、通量大、成本低、不受检测位点局限，既可以检测已知突变又可发现未知突变等优点，已经在多个领域中得到了广泛的应用。本研究拟建立高分辨率熔解曲线分析方法，对常见的CD36基因突变进行筛查。然而，无论使用何种方法，通常需要已确认的DNA样品对建立的方法进行评价和质量控制，但由于DNA样品本身的限制性，其作为大规模筛查的标准品有其自身不足之处，因此需要克隆相应的质粒作为标准品。本研究首先利用重叠延伸PCR定点突变的方法获取CD36基因突变片段，然后通过TA克隆技术分别构建含有CD36基因A1237C、C268T、329-330delAC突变片段的野生型和纯合突变型质粒，为后续建立高分辨率熔解曲线分析（HRM）方法筛查CD36基因多态性奠定物质基础。 1、材料与方法 材料 DNA提取酚试剂（北京索莱宝公司，货号：T0250）、核酸抽提试剂（24∶1北京索莱宝公司，货号：P1014）、3M乙酸钠（北京索莱宝公司，货号：A1070）、X-gal（北京索莱宝公司，货号：X1010）、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（北京索莱宝公司，货号：I8070）、DNAMarker（北京索莱宝公司，货号：M1100）均购自广州昂飞生物公司、克隆菌α感受态细胞（Taraka，货号：9057）、PrimeSTARHSDNAPolymerase(Takara，货号：R010A）、TakaraExTaq?DNAPolymerase(Takara，货号：RR001Q）、pMD19-TVectorCloningKit(Takara，货号：6013）均购自广州瑞真公司，质粒小提试剂盒（Magen，货号：D2110-02）均购自广州美基生物公司。 方法 健康人乙二胺四乙酸二钾（EDTA-K2）抗凝外周全血来源于南方医科大学深圳医院输血科。取1mL全血样本，采用酚氯仿法提取外周血基因组DNA，具体方法详见产品说明书。最后用30μLTE缓冲液溶解血基因组DNA，置于-20℃冻存备用。 基于重叠延伸PCR定点突变的原理，使用Primer3Plus引物设计网站设计针对CD36基因A1237C、C268T、329-330delAC突变的引物，每个突变位点共4条引物，见表1。F和R分别代表侧翼上游和下游引物，用于扩增含突变位点的全长片段。Fm和Rm为引入突变位点的突变上游和下游引物，并且部分序列重叠互补，与侧翼引物配对扩增含有突变位点的上、下游序列。 表1引物序列 注：下划线表示碱基替换或缺失位点。 重叠延伸PCR定点突变是通过2轮PCR扩增来完成的。第1轮PCR以经过双向测序验证为CD36基因野生型的健康人血基因组DNA为模板，以侧翼上游和突变下游为引物，在高保真酶的作用下进行PCR扩增获得含有突变位点的上游序列。同时，以经过双向测序验证为CD36基因野生型的健康人血基因组DNA为模板，以侧翼下游和突变上游为引物，在高保真酶作用下进行PCR扩增，获得含有突变位点的下游序列。这两个反应同时进行，最后获得含有重叠片段的PCR产物，将其经过切胶回收纯化后，等浓度、等量混合。第2轮PCR扩增以上述混合PCR产物为模板，以侧翼上游引物和侧翼下游引物为模板，在Taq酶作用下进行PCR扩增，获得含有突变位点的全长片段。同样以健康人血基因组DNA为模板，侧翼上游引物和侧翼下游引物为引物，在Taq酶作用下进行PCR扩增，获取野生型片段。 .1第1轮PCR扩增 以经过双向测序验证为CD36基因野生型的健康人血基因组DNA为模板，引物F与Rm、Fm与R搭配，在高保真酶的作用下进行PCR扩增。反应体系为50μL:μLPrimeSTARHSDNAPolymerase(/μL)，4μLdNTPmixture(/Leach)，10μL5×PrimeSTARbuffer(Mg2+Plus)，1μL引物（5pmol)，200ng模板，加灭菌双蒸水至50μL。PCR扩增条件：98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸10min，共40个循环。最后置于4℃保存30