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新型荧光探针组合应用于CTCs中鉴定的研究 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：新型荧光探针组合应用于CTCs中鉴定的研究 1 1、材料与方法 3 2、结果 5 3、讨论 6 文2：不同类型氟离子荧光探针的研究进展 7 1 氢键型 8 2 路易斯酸受体型 12 3 氢键和路易斯酸混合型 16 4 总结与展望 17 参考文摘引言： 17 原创性声明（模板） 18 文章致谢（模板） 19 正文 新型荧光探针组合应用于CTCs中鉴定的研究 文1：新型荧光探针组合应用于CTCs中鉴定的研究 随着发病率和死亡率的增加，癌症已经成为我国最主要死亡原因之一[1]。其中超过90%的癌症患者死于肿瘤转移[2]。1889年英国病理学家Paget[3]指出循环肿瘤细胞作为“种子”在肿瘤发生、转移过程中起了重要的作用。循环肿瘤细胞是指自发或因诊疗操作自肿瘤原发灶或者转移病灶脱落进入外周血循环系统的肿瘤细胞[4]。CTCs的检测是一个复杂的过程，涉及细胞分离、富集和鉴定，检测CTCs的关键在于如何提高CTCs的截留率和如何对截留的细胞进行识别鉴定[5，6]。鉴定CTCs的方法按照其应用的原理不同，可归纳为4类，即：形态学鉴定方法、免疫学鉴定方法、遗传学鉴定方法和细胞生物化学鉴定方法[7，8，9，10，11，12]，目前尚无明确的鉴定CTCs的“金标准”。CTCs是癌细胞的一种特殊存在方式[13]，课题组认为解决CTCs鉴定的方法可以借鉴传统病理学对癌细胞的鉴定。目前活检是传统病理学临床疾病诊断的金标准[14]。活检区分癌细胞和非癌细胞的方法可以归纳为三个方面：病理形态学改变、生物学行为改变和相关技术检测结果[15]。结合传统病理学诊断技术、ISET技术和免疫学方法，本课题组提出了物理方法捕获-形态方法识别-免疫方法鉴定的检测思路[16]。依据上述思路，前期课题组建立并验证了“ISET-ICC技术”[17]。“ISET-ICC技术”先通过物理方法捕获CTCs，再以形态学方法识别CTCs，最后利用ICC法排除血液来源细胞的方法鉴定CTCs[16，17，18]。这种“阴性排除”的方法，对形态学疑似CTCs的非血液来源细胞无法识别，课题组需要探索一种新的“直接”鉴定CTCs的方法。 荧光探针是一种与靶标结合后可以产生荧光光谱变化的探针，并且这种变化能用来检测细胞内的靶标。在应用探针时首先是在一个复杂的细胞内环境中确定一个明确靶标，这种靶标可以是分子、离子、细胞器或其他实体，荧光探针与之结合使目标可以被检测并且可用光度法和显微镜直接定量[19]。新型荧光探针组合是利用多种荧光探针复合染色的方法，可分别标记细胞膜、细胞核、核仁、线粒体、细胞器等。课题组希望利用新型荧光探针（DiI、Hoechst33342和PY组合）染色CTCs的细胞结构，达到“直接”鉴定CTCs的目的。 课题组选取食管癌Eca-109和宫颈癌HeLa这两种肿瘤细胞系进行新型荧光探针（DiI、Hoechst33342和PY组合）用于CTCs鉴定的实验，初步确定了新型荧光探针组合（DiI、Hoechst33342和PY组合）鉴定CTCs的SOP。课题组选取符合入组标准的5例恶性肿瘤患者，验证了新型荧光探针组合染色患者外周血的CTCs的可行性和鉴定标准并优化了SOP。 1、材料与方法 材料 HeLa细胞系山东大学功能晶体材料实验室赠与（中国科学院细胞库编号：TCHu187);Eca-109细胞系是山东省肿瘤医院中心实验室赠与（中国科学院细胞库编号：TCHu69），用37℃的胰蛋白酶分解为稳定的单细胞悬液。 选取2017年6月–2017年8月期间在山东省肿瘤防治研究院接受治疗且符合入组标准的5例恶性肿瘤患者，其中食管癌4例，肝癌1例。入组标准：(1)患者有明确的临床或病理诊断；(2)年龄≥18岁；(3)患者及家属同意并签署知情同意书。排除标准：(1)伴有第二原发的恶性肿瘤；(2)患有皮肤病病史；(3)患有严重的血管病变，如脉管炎等。本试验已通过山东省肿瘤防治研究院伦理委员会的审核批准，符合条件的受试者入组前均签署书面知情同意书。 方法 按照1:.5的比例配制Hoechst33342、PY和DiI工作液。用Hoechst33342、PY和DiI的工作液对细胞进行染色，在盖玻片的一角加入100μl的染料工作液，轻轻晃动使染料均匀覆盖所有细胞，然后在室温下放置30min。放置到荧光显微镜下选择三个通道，第一个通道采集Hoechst33342的光，选用405nm作为激发光，收集420～470nm的荧光；第二个通道采集PY的光，选用405nm作为激发光，收集500～560nm的荧光；第三个通道采集