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杂交瘤细胞融合技术 细胞融合是杂交瘤技术的中心环节，基本步骤是将两种细胞混合后加入PEG使细胞彼此融合。其后吧培养液稀释PEG，消除PEG的作用。将融合后的细胞适当稀释，分置培养板孔中培养。融合过程中有几个问题应特别注意。①细胞比例：骨髓瘤细胞与脾细胞的比值可从1:2到1:10不等，常用1:4的比例。应保证两种细胞在融合前都具有较高活性。②反应时间：在两种细胞的混合细胞悬液中，第1min滴加4.5ml培养液；间隔2min滴加5ml培养液，尔后加培养液50ml。③培养液的成分：对融合细胞，良好的培养液尤其重要，其中的小牛血清、各种离子和营养成分均需严格配制。如融合效率降低，应随时核查培养基情况。 1．细胞融合前准备 　　（1）骨髓瘤细胞系的选择：骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。常用的骨髓瘤细胞系见表2-4。 表2-4用于融合试验的主要骨髓瘤细胞系 名 称 来 源 耐 受 药 物 Ig链 H L P3/X63-Ag8(X63) BALB/C骨髓瘤MOPC-21 8－氮鸟嘌呤 r1 　K P3/X63-Ag8.653(X63-Ag8.653) P3/X63-Ag8 8－氮鸟嘌呤 － － P3/NSI-1-Ag4-1(NS-1) P3/X63-Ag8 8－氮鸟嘌呤 － K（不分泌型） P3/X63-Ag8.Ul(P3Ul) （X63×BALB/C脾细胞）杂交瘤 8－氮鸟嘌呤 － － SP2/0-Ag14(SP2/0) （X63×BALB/C脾细胞）杂交瘤 8－氮鸟嘌呤 － － F0 BALB/C骨髓瘤 8－氮鸟嘌呤 － － S194/5.XXO.BU.1 P3/X63-Ag8 5－溴脱氧尿嘧啶核苷 － － MPC11-45.6TG1.7 BALB/C骨髓瘤MPC-11 6－巯鸟嘌呤 r2b 　K 210.RCY3.Ag1.2.3 LOU大鼠骨髓瘤R210 8－氮鸟嘌呤 －　 K GM15006TG-A12 人骨髓瘤GM1500 6－巯鸟嘌呤 r1 　K U-266AR 人骨髓瘤U-266 8－氮鸟嘌呤 ε　　λ 　　骨髓瘤细胞的培养可用一般的培养液，如RPMI1640，DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在10%～20%，细胞浓度以104～5×105/ml为宜，最大浓度不得超过106/ml。当细胞处于对数生长的中期时，可按1：3～1：10的比例传代。每3～5天传代一次。细胞在传代过程中，部分细胞可能有返祖现象，应定期用8－氮鸟嘌呤进行处理，使生存的细胞对HAT呈均一的敏感性。 　　（2）饲养细胞：在组织培养中，单个或少数分散的细胞不易生长繁殖，若加入其它活细胞，则可促进这些细胞生长繁殖，所加入的这种细胞数被称为饲养细胞。在制备McAb的过程中，许多环节　需要加饲养细胞，如在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞（较为常用）、小鼠脾脏细胞或胸腺细胞。也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞。饲养细胞的量为一般为2×104或105细胞/孔。 2．细胞融合的步骤 　　（1）制备饲养细胞层：一般选用小鼠腹腔巨噬细胞。 　　与免疫小鼠相同品系的小鼠，常用BALB/C小鼠，6～10周 ↓ 　　拉颈 处死，浸泡在75%酒精内，3～5min 　　↓ 　　用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜 　　↓ 　　用无菌注射器注入5～6ml预冷的培养液（严禁刺破肠管） 　　↓ 　　反复冲洗，吸出冲洗液 　　↓ 　　冲洗液放入10ml离心管，1200rpm/分离5～6min 　　↓ 　　用20%小牛血清（NCS）或胎牛血清（FCS）的培养液混悬，调整细胞数至1×105/ml 　　↓ 　　加入96孔板，100μl/孔 　　↓ 　　放入37。c CO2孵箱培养 　　（2）制备免疫脾细胞 　　最后一次加强免疫3天后小鼠拉颈处死 　　↓ 　　无菌取脾脏，培养液洗 一次 　　↓ 　　脾脏研碎，过不锈钢筛网 　　↓ 　　离心，细胞用培养液洗2次 　　↓ 　　计数 　　↓ 　　取108脾淋巴细胞悬液备用 　　（3）制备骨髓瘤细胞 　　取对数生长骨髓瘤细胞离心 　　↓ 　　用无血清培养液洗2次 　　↓ 　　计数，取得×107细胞备用 　　（4）融合 　　①将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml离心管中用无血清不完全培养液洗1次，离心，1200rpm,8min；弃上清，用吸管吸净残留液体，以免影响聚乙二醇（PEG）浓度。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动。 　　②90s内加入37℃预温的1ml 45%PEG（分子量4000）溶液，边加边轻微摇动。37℃水浴作用90s。 　　③加37。C预温的不完全培养液以终止PE