线虫unc-22突变基因的克隆实验原理和操作步骤-1.docxVIP

线虫unc-22突变基因的克隆实验原理和操作步骤-1 【实验原理】外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA 连接酶的作用下，有Mg2+ 、ATP存在的连接缓冲系统中，将载体分子与外源DNA分子进行连接。Taq DNA聚合酶扩增的PCR产物，其DNA双链前后末端都有一个游离的A碱基，可以与pMD18-T Vector 末端游离的T碱基互补形成环状重组T质粒。将携带目的基因的T质粒转入大肠杆菌并对其进行蓝白斑筛选鉴定，挑选出所需的重组质粒。【实验器材】F 试剂耗材：Taq DNA聚合酶、安苄青霉素、葡萄糖、X-gal、IPTG、pMD18-T载体、LB培养基、培养皿、涂玻棒、移液枪、枪头、1.5ml离心管、PCR 管、溶液I、溶液II、溶液III、苯酚、三氯甲烷、95%乙醇、无水乙醇、RNAase A、DNA Marker。F 仪器：PCR仪、恒温培养箱、恒温摇床、恒温水浴锅、离心机、无菌操作台。【方法步骤】（一） 引物设计从NCBI上下载线虫unc-22基因序列（GenBank登录号：NM_069873），依照此序列用 Primer 5.0软件分别设计上游和下游扩增引物。（二） 目的基因片段的PCR扩增25μl反应体系：模板cDNA 1.5μl10×reaction buffer 2.5μl2.5mM MgCl2 2μl2.5mM dNTP 2μl上游引物 1μl下游引物 1μlTaq DNA聚合酶 0.2μl加ddH2O至总体积 25μl按照以下程序进行PCR扩增：94℃预变性4min；94℃变性40s，56℃退火40s，72℃ 延伸1min，共30个循环；72℃总延伸10min，4℃保存。取5μl PCR产物与荧光染料混合均匀在1%琼脂糖凝胶电泳(1×TAE电泳缓冲液、100V恒压)，用凝胶成像系统照相观察，确定所得DNA片段的大小和纯度。（三）目的基因片段PCR产物的纯化回收将PCR产物与荧光染料混合均匀进行1%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统下用干净刀片切下含目的基因片段的胶带。按照北京鼎国生物技术有限公司生产的DNA快速纯化/回收试剂盒操作说明，纯化回收目的片段。