临床基因扩增检验的质量保证(新-临床聚合酶链反应测定的质.ppt

Levey-Jennings质控图方法的特点 优点是简单明了； 缺点： 以±2s为失控限，假失控的概率太高，通常不能接受； 以±3s为失控限，假失控的概率低，但误差检出能力不强。 Levey-Jennings质控图结合Westgard多规则质控方法 Westgard多规则质控方法即是将前述的多个质控规则同时应用进行质控判断的方法。最初常用的有六个质控规则，即12S、13S、22S、R4S、41S和10X，其中12S规则作为告警规则，当出现质控测定值违反12S规则时，则起动其它规则进行判断。只有当使用所有质控规则判断确定某测定批在控时才说明该测定批在控，只要上述质控规则之一判断测定批失控则即认为该测定批失控。通常上述规则中，13S和R4S规则反映的是随机误差，而22S、41S和10X反映的是系统误差，系统误差超出一定的程度，也可从13S和R4S规则反映出来。 Westgard多规则质控方法的特点 其是在Levey-Jennings质控图方法的基础上产生的，自然也就具有Levey-Jennings质控图方法的优点，可通过相似的质控图来进行分析； 假失控和假告警概率低； 误差检出能力增强 。 理想的试剂和操作方法 试剂盒的质检 定量测定的精密度是测定组成步骤的变异和的平方根(SD)= 上式中SDa、SDb、SDc是步骤a、b、c等（例如试剂准备、标本采集、核酸提取、扩增和产物检测等）的标准差； 理想的试剂和操作方法 改善测定精密度的措施必须首先着重在最不精密的步骤上，应对试剂准备、标本收集、核酸提取、测定方法和仪器操作写出“标准操作程序”(SOP) 人员培训 临床基因扩增检验的操作主要是标本处理中的核酸提取步骤，这其中所涉及的又主要是加样器的使用，尽管操作简单，但由于均为微量操作，要获得稳定可靠的测定结果，操作人员需要一定的专业技术知识和经验，要尽可能做到知其然又知其所以然。 核酸样本的制备、扩增检测及其质量控制 一般核酸提取试剂促使靶核酸从细胞内释出的原理 核酸的分离纯化 靶核酸提取的质量 临床标本及核酸提取中可能存在的抑制和干扰物质 核酸样本制备及扩增检测的质控 产物检测的质控 一般核酸提取试剂促使靶核酸从细胞内释出的原理 靶核酸可以与宿主细胞整合，核内游离及胞浆内各种构形存在于细胞内，如测定的是病原微生物,则靶核酸存在于细菌、病毒、原虫或真菌细胞内，如果上述细胞破裂,则靶核酸亦可存在于细胞外。 一般均使用去垢剂(如Triton-100)裂解细胞，用一种蛋白裂解酶(如蛋白酶K)消化结合于核酸的蛋白质，从而将靶核酸从细胞内释放出来。 核酸的分离纯化 核酸的分离纯化就是要将蛋白、脂类等干扰核酸扩增的物质去除。 经典方法 硅吸附法 对于商品核酸提取试剂盒，临床实验室在使用前，必须对其核酸提取纯度和效率进行评价。 靶核酸提取的质量 纯化的靶核酸的完整性：可使用凝胶电泳将样本的核酸提取物与一核酸标准比较测定。 核酸提取的产率：可在A260读数测定。 核酸纯度：可通过提取物A260/A280比率判定 血清或血浆中病原体核酸纯化纯度：采用一种间接的方法，即使用已知病原体含量的溶血和/或脂血标本用待评价试剂提取，然后进行扩增检测，比较所得到的结果 临床标本及核酸提取中可能存在的抑制和干扰物质 临床标本中：血清或血浆中的血红素及其代谢产物、痰中酸性多糖和糖蛋白成份 、降解靶核酸的核酸酶等。 核酸提取中：许多试剂如乙二胺四乙酸(EDTA)、去垢剂如十二烷基硫酸盐(SDS)和chaotrope试剂如异硫氰酸胍和盐酸胍等、酚、氯仿、乙醇等有机溶剂 。 核酸样本制备及扩增检测的质控 对临床标本中可能存在的抑制/干扰物的质控措施 核酸提取及扩增有效性的质控 对临床标本中可能存在的抑制/干扰物的质控措施 质控措施： 采用内质控（internal control, IC）（通常称为内标）的方法 内标有两种,即竞争性的和非竞争性的内标。 内标设置的必要性？ 核酸提取及扩增有效性的质控 已知弱阳性质控样本（基质与待测标本相同）：至少带1份，其最后的检测结果，应是核酸提取和扩增检测的有效性的综合反映。 已知阴性质控样本（基质与待测标本相同）：至少带1份，扩增测定的结果可以判断核酸提取过程中是否发生污染。 统计学质量控制 理想的室内质控样本的条件 测定中质控样本的设置、数量及排列顺序 统计学质控的特点 统计质控方法 理想的室内质控样本的条件 基质与待测样本一致； 所含待测物浓度接近试验的决定性水平； 稳定； 靶值或预期结果已定； 无已知的生物传染危险性； 单批可大量获得； 价廉 测定中质控样本的设置、数