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羊水穿刺：羊水细胞的培养及染色体核型分析 谢雨琪羊水穿刺，全称“羊膜腔穿刺”，是我国目前最常用的一种有创产前诊断技术，是指在超声引导下经腹羊膜腔穿刺抽取羊水后，取出羊水中含有胎儿脱落的上皮细胞进行培养，抽取其中细胞分析胎儿染色体核型的检查，主要涉及的生物技术是羊水细胞的培养及染色体核型分析。 ·技术原理 1）羊水细胞 羊水是指怀孕时子宫羊膜腔内的液体。在整个怀孕过程中，它是维持胎儿生命所不可缺少的重要成分。在胎儿的不同发育阶段，羊水的来源也各不相同。在妊娠第一个三月期，羊水主要来自胚胎的血浆成分。之后，随着胚胎的器官开始成熟发育，其他诸如胎儿的尿液、呼吸系统、胃肠道、脐带、胎盘表面等等，也都成为了羊水的来源。因此，羊水中会含有来自胎儿的脱落细胞，羊水细胞具有相同的遗传信息，可用于检查胎儿染色体核型。 2）分析染色体核型 不同物种的染色体都有各自特定的形态结构（包括染色体的数目、长度、着丝点位置、臂比、随体大小等）特征，而且这种形态特征是相对稳定的。经染色或荧光标记的染色体，通过一定的光学或电化学显色设备就可以清晰而直观的观察到染色体的具体形态结构，再与正常核型进行对比寻找差异，进而确定染色体的缺失、重复和倒置等现象。 通过染色体核型分析，可以根据染色体结构和数目的变异情况来判断生物是否患有某种因染色体片段缺失、重复或倒置等引起的遗传病。如产前21三体综合征的诊断，通过核型分析可以在遗传基础上确定该疾病。 染色体结构异常核型 （图片来自实用医学杂志2012年第28卷第11期第1857页） ·技术应用 一般是在妊娠中期约16周至24周，在超声实时监护下，用细针经腹部穿刺进针，穿过子宫壁，进入羊膜腔后抽取20ml羊水，将羊水中的胎儿细胞收集起来，培养2周后经过特殊处理，得到胎儿染色体并进行核型分析，以获取有关胎儿健康和发育情况的信息。 羊水穿刺属非强制性产前检查，主要适用于以下人群： ①所有希望获得胎儿染色体明确诊断、无穿刺禁忌症的中孕期孕妇； ②孕早、中期血清筛查高危的孕妇； ③≥35岁的高龄孕妇； ④夫妇一方为染色体病患者，或曾妊娠、生育过染色体病患儿的孕妇； ⑤超声畸形筛查发现异常的孕妇； ⑥无创产前DNA检测（NIPT）发现异常的孕妇。 具体操作： 1）羊水抽取 在Ｂ超引导下，抽取羊水２０ｍＬ置入２支１５ｍＬ的无菌离心管中。 2）羊水细胞培养 羊水离心后，弃上清，每管留０．５ｍＬ 打匀后接种到２５ｃｍ2培养瓶中，加入３ｍＬ培养基，每例样本接种两瓶，放入到３７℃、５％ＣＯ２培 养箱中培养。第６天取出换液，第７天取出培养瓶， 在倒置显微镜观察，见到较多的圆而亮的克隆细胞，进行传代。 3）羊水细胞染色体制片 加入秋水仙素 ３０ μＬ， 置于３７℃、５％ＣＯ２培养箱中继续培养４ｈ，用胰酶消化，进行低渗、预固定、固定、冰片滴片等操作步骤。每标本滴片４张，在６５℃的烤箱中烤过夜，行胰酶消化，Giemsa染色。 4）核型分析 在蔡司自动分析仪下至少计数 ３０ 个分散好的中期分裂相， 嵌合体至少要计数１００个分裂相，同时分析５个带纹清晰的染色体核 型图，对于易位、倒位、长臂末端缺失和小Ｙ等特殊情形必要时做家系调查及亲属染色体分析。 ·技术优点 1）羊水穿刺应用于产前诊断已有30多年的历史，准确性得到医学界的公认，应用羊水穿刺术来检测胎儿染色体异常的准确率高达99%以上。 2）最终出具的核型分析报告覆盖23对染色体，既可知道胎儿染色体数目异常（最常见的是21三体、18三体、13三体），也可诊断结构异常，例如平衡易位、非平衡性结构异常、标记染色体等，因此诊断范围非常广，基本上涵盖了所有染色体疾病。对于携带单基因遗传病致病基因的家庭，羊水穿刺还可以对胎儿是否患遗传性疾病做出诊断。 ·技术缺点 1）羊水穿刺具有一定风险，发生各种风险的比例为1/250～1/300不等，即每1000次穿刺中有3～4例孕妇可能发生问题。通常可能有出血、流产、感染、羊水渗漏、损伤胎儿等，有时还会因为子宫畸形、羊水量少等原因，发生羊水穿刺失败。 2）特殊血型Rh阴性血型的孕妇，穿刺手术会增加胎儿和母亲之间血液的交换，增加新生儿溶血的风险，需要注射Rh免疫球蛋白来进行主动免疫。对于活动性乙肝的患者，穿刺可能增加胎儿垂直传播乙肝病毒的风险，也需要进行乙肝免疫球蛋白的注射。 3）常规的羊水穿刺后，要经过羊水的培养、收获、染色、读片等一系列步骤，一般需要几周等待的时间。孕周逐渐增大、胎动越来越明显，而几周后可能被告知胎儿有问题，需要进行引产。即便几周的时间对孕妇及其家庭是一种煎熬。 尽管拥有上述缺点，羊水染色体核型分析仍然是主要产前诊断手段之一，分子遗传带了新技术，例如：光谱分析（SRY）、多色 FISH（M-FISH）、微阵列比较基因组杂交技术（ar